激光掃描共聚焦顯微鏡第一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點:1.點照明,具有照明pinhole和探測pinhole2.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面3.具有掃描系統(tǒng)——逐點掃描成像4.激光作為光源5.具有多個（四個）熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物第二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope第三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日人眼分辨率： 0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25mm電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：0.18mm第四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日電子顯微鏡的缺點：1.由于樣品需要固定,觀測活細(xì)胞十分困難.2.樣品制備過程（固定、包埋、切片）造成的假象熒光顯微鏡的缺點:1.無法實現(xiàn)對熒光,透射光的同時采集,無法實現(xiàn)多熒光的同時采集2.熒光散射光太強，造成實際分辨率的大大下降。3.熒光漂白很快，使熒光圖像的拍照有困難。4.無法對樣品進行斷層掃描,完成3D的工作.5.對于信號較弱的樣本,無法提高觀察的靈敏度.6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊第五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用單、雙、三,四色標(biāo)記檢測。精確的一、二、三、四維觀察。高品質(zhì)的熒光成像、透射成像、物體表面反射成像。靜態(tài)和動態(tài)觀察(CA2+,pH,膜電位,膜流動性等)。定性以及定量分析。光譜掃描,ROI掃描.特殊的光反應(yīng)(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。第六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日時間分辨和快速掃描動態(tài)圖像出色的反射光圖像明場，DIC,相差和透射光圖像

單標(biāo)，雙標(biāo)和三標(biāo)圖像

激光共聚焦顯微成像技術(shù)的應(yīng)用第七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日

一.定位、定量免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位、定量如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與

共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位、干細(xì)胞的分化細(xì)胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI

末端原位雜交-fitc+PI熒光原位雜交：染色體基因定位單細(xì)胞凝膠電泳GFP的表達(dá)活細(xì)胞或活體組織靜息游離Ca2+

的分布與定量活細(xì)胞內(nèi)pH的定量、膜電位的測量活細(xì)胞內(nèi)自由基水平的定量

第八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日Helagreen-中心體red-紡錘體

Immuno-fluorecencelabel第九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日

二.光學(xué)切片和三維重組光學(xué)切片和三維重組:LSCM通過薄層光學(xué)切片功能，可獲得標(biāo)本真正意義上的三維數(shù)據(jù)，經(jīng)計算機圖像處理及三維重建軟件，產(chǎn)生生動逼真的三維效果，可進行形態(tài)學(xué)觀察，并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系，用以闡明三維結(jié)構(gòu)與組織功能之間的關(guān)系。第十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日顯微CT與三維重組第十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日3Dreconstruction第十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日

三.動態(tài)測量游離Ca2+,Mg2+、K+、Na+測量pH值的檢測

自由基的檢測第十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日相對測量程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進行不同時間序列的掃描測量

F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)第十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日四.細(xì)胞膜電位的測量標(biāo)記膜電位探針(慢反應(yīng)）：JC1510nm 530/590nmDioc5(3)548nm 573nmDioc6(3)484nm 500nm快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS496nm 703nmDi-4-ANEPPS498nm 713nm細(xì)胞膜靜息膜電位：-70mV線粒體膜電位：-150mV以上均屬于陽離子探針，更容易與線粒體親和，為線粒體膜電位探針

第十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日FRAP(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching)原理IntenselaserBeamBleachesFluorescenceRecoveryoffluorescence10seconds30secondsZerotimeTime%F五.熒光漂白恢復(fù)(FRAP:FluorescenceRecoverafterphotobleaching）第十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日熒光光漂白后的回復(fù)：FRAP生物膜脂質(zhì)分子的側(cè)向擴散；胞間通訊的研究；胞漿及細(xì)胞器內(nèi)小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)移性的觀測等細(xì)胞骨架構(gòu)成、核膜結(jié)構(gòu)及大分子組裝等。第十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日六．熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致第十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)

生物大分子結(jié)構(gòu)和功能研究免疫分析核酸雜交分析蛋白質(zhì)間相互作用研究r:分子間距離R0:分子間發(fā)生50%能量轉(zhuǎn)移的距離

DAr>2R0Dr<2R0A第十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日檢測以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉(zhuǎn)移時，只檢測到FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時，就可檢測出

FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強。應(yīng)用：檢測大分子的相互作用大分子構(gòu)象的改變(蛋白)例：大分子(亞基)的結(jié)合與分離受體與配體的結(jié)合

常用熒光探劑：FITC/TRITC,Cy3/Cy5,BFP/GFP

第二十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日曲霉?fàn)I養(yǎng)菌絲橫隔不同霉菌自發(fā)熒光成像，示普通光學(xué)顯微鏡下不曾觀察到的現(xiàn)象微生物自發(fā)熒光Confocal成像第二十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日植物學(xué)應(yīng)用:

植物細(xì)胞中的微管列陣(microtubulearray)周質(zhì)微管早前期微管帶紡錘體成膜體第二十二頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日農(nóng)業(yè)的應(yīng)用:

植物細(xì)胞中的微絲分布煙草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中的微絲網(wǎng)絡(luò)第二十三頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日農(nóng)業(yè)的應(yīng)用:

花粉萌發(fā)過程中微絲骨架的變化第二十四頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日農(nóng)業(yè)的應(yīng)用:

Jasplakinolide解聚微絲的實時觀察第二十五頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日Zaslavskaiaet.al,MartekBiosciences,MD,June15,2001第二十六頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日November

2001;Volume128(21):pp4301-4314.Courtesy:Jose-EduardoGomes,UniversityofOregon,USANature,25April2002,pg854第二十七頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日第二十八頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日GFP-MAP4融合蛋白表達(dá)顯示微管骨架（美國Cyr實驗室）第二十九頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日奶山羊發(fā)育中乳腺上皮細(xì)胞主要細(xì)胞器的變化為研究奶山羊乳腺的胚后形態(tài)發(fā)育，采用活細(xì)胞熒光標(biāo)記法結(jié)合激光共聚焦顯微技術(shù)，觀察奶山羊乳腺發(fā)育中主要細(xì)胞器的變化。根據(jù)奶山羊乳腺發(fā)育特點，采樣時點分為：妊娠期1月、3月、5月；泌乳期10日、30、60日、120日；退化期3日、7日、21日，共計10個時點。第三十頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日主要試劑及耗材

DMSO購自Sigma公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS）、DF12培養(yǎng)基、I型膠原酶均購自Gibco公司；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)熒光探針（E-34251，激發(fā)/發(fā)射波長為504/511nm）、線粒體熒光探針（M-7512，激發(fā)/發(fā)射波長為579/599nm）、Hochest33258均購自Invitrogen公司。Confocal專用細(xì)胞培養(yǎng)皿購自北京博蕾德科技公司。奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

無菌切取1~3g乳腺組織，膠原酶消化法進行乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。對膠原酶濃度及消化時間進行優(yōu)化，確定最適酶濃度為400U/ml，消化時間為3.5小時。以1x106個/ml的密度鋪于Confocal專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞生長情況。2~3天更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞生長約80％~90％匯合度時，進行細(xì)胞器熒光檢測。第三十一頁，共三十二頁，編輯于2023年，星期日乳腺上皮細(xì)胞主要細(xì)胞器的檢測37℃預(yù)熱、終濃度為50nmol/L的M-7512工作液，37℃染色40min；37℃預(yù)熱、終濃度為1μmol/L的E-34251工作液，37℃染色30min10μg/ml的Hochest33258復(fù)染5min圖像采集與數(shù)據(jù)處理激光掃描共聚焦顯微鏡使用三通道（PMT）檢測。激發(fā)譜線：405