基因工程基本原理及操作程序當(dāng)前第1頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。當(dāng)前第2頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)蘇云金桿菌毒蛋白基因毒蛋白殺死害蟲棉花細(xì)胞抗蟲棉的培育當(dāng)前第3頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。通俗的說就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向的改造生物的遺傳性狀。當(dāng)前第4頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）

——DNA連接酶基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運(yùn)輸車”）

——運(yùn)載體一、DNA重組技術(shù)的基本工具準(zhǔn)確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”）

——限制酶當(dāng)前第5頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)

特點(diǎn)：一種限制酶只能識別DNA的一種核苷酸序列，并在特定的位點(diǎn)切割DNA.1、限制酶當(dāng)前第6頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)限制性內(nèi)切酶限制酶當(dāng)前第7頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)限制酶切割的是么？DNA分子

切割DNA分子兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。當(dāng)前第8頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)切割DNA分子后形成什么？黏性末端（在中軸線兩側(cè)切割DNA）平末端（在中軸線處切割DNA）當(dāng)前第9頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)

會產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。

如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？當(dāng)前第10頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第11頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)

將雙鏈DNA分子片段“縫合”起來，恢復(fù)兩個(gè)脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。DNA連接酶連接的是什么？2、DNA連接酶當(dāng)前第12頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)AATTGCCTTAAG磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵當(dāng)前第13頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因的針線：DNA連接酶

G

AA

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CC

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G剪刀：用同種限制酶切割當(dāng)前第14頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)DNA連接酶的種類T4

DNA連接酶：連接黏性末端和平末端E·coliDNA連接酶：黏性末端當(dāng)前第15頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)3、運(yùn)載體

常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒等標(biāo)記基因，便于進(jìn)行檢測。

質(zhì)粒存在于許多細(xì)菌和酵母菌等生物中,是擬核或細(xì)胞核外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子.

當(dāng)前第16頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)特點(diǎn)：

1.結(jié)構(gòu)簡單，能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。

2.具多種限制酶的單一切點(diǎn)，以便與外源基因連接。

3.具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。

4.對宿主細(xì)胞沒有傷害。作用：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞常用運(yùn)載體：質(zhì)粒

動植物病毒噬菌體當(dāng)前第17頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定當(dāng)前第18頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)一、目的基因的獲取1、目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的基因2、獲取目的基因的常用方法?①從基因文庫中獲?、诶肞CR技術(shù)擴(kuò)增③人工合成當(dāng)前第19頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)①從基因文庫中獲取目的基因基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）當(dāng)前第20頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因組文庫

通過對受體菌群體的培養(yǎng)而儲存一種生物的全部基因。當(dāng)前第21頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)cDNA文庫的構(gòu)建提取生物某發(fā)育時(shí)期mRNA單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈的cDNA(只含該生物的部分基因)與載體連接導(dǎo)入受體菌群儲存起來當(dāng)前第22頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因組文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較當(dāng)前第23頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)不能轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)啟動子終止子內(nèi)含子：外顯子：當(dāng)前第24頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因組文庫和cDNA文庫的比較當(dāng)前第25頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③人工合成法：

基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀人工合成。當(dāng)前第26頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。質(zhì)粒

目的基因

啟動子

終止子二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建當(dāng)前第27頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來當(dāng)前第28頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)①用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。②用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生____________③將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的________處，再加入適量_______________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。限制酶黏性末端同一種限制酶相同的黏性末端切口DNA連接酶

用同種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，使之露出相同的粘性末端，再加入DNA連接酶。當(dāng)前第29頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化

方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程?！狢a

處理細(xì)胞

2+當(dāng)前第30頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點(diǎn)：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。原理：Ti質(zhì)粒上的T—DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。當(dāng)前第31頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)基因槍法：單子葉植物花粉管通道法：抗蟲棉當(dāng)前第32頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)

目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射轉(zhuǎn)基因受精卵轉(zhuǎn)基因動物顯微注射法當(dāng)前第33頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)顯微注射法當(dāng)前第34頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞當(dāng)前第35頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)四、目的基因的檢測與鑒定四環(huán)素抗性基因

青霉素抗性基因大腸桿菌當(dāng)前第36頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)四、目的基因的檢測與鑒定分子水平檢測個(gè)體水平鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——DNA分子雜交方法——抗原-抗體雜交抗蟲鑒定、抗病鑒定等方法——DNA分子雜交當(dāng)前第37頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)

DNA分子雜交原理：互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)配對進(jìn)行。因此，當(dāng)用探針和轉(zhuǎn)基因生物的DNA雜交時(shí)候，如果出現(xiàn)雜交帶（用特殊的顯影裝置可以看見），則說明目的基因已插入受體細(xì)胞的染色體DNA中。

基因探針：是一小段單鏈的DNA或RNA，帶有放射性同位素標(biāo)記，并能與目的基因的的一條鏈發(fā)生堿基互補(bǔ)配對。當(dāng)前第38頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)當(dāng)前第39頁\共有40頁\編于星期五\7點(diǎn)②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法——DNA與mRNA雜交③檢測目的