（優(yōu)選）基層培訓(xùn)免疫學(xué)技術(shù)當前第1頁\共有102頁\編于星期五\7點臨床免疫檢驗是運用免疫學(xué)基本的基本原理和技術(shù)，檢查臨床標本中的微生物抗原、腫瘤抗原以及相應(yīng)的微生物抗體、自身抗體，為感染性性疾病、腫瘤、自身免疫病以及免疫缺陷提供診斷依據(jù)。當前第2頁\共有102頁\編于星期五\7點免疫檢驗分為兩個部分，一部分為利用免疫檢測原理檢測免疫活性細胞、抗原、抗體、補體、細胞因子、細胞粘附分子等免疫相關(guān)物質(zhì)，另一部分是利用免疫檢測原理檢測體液中微量物質(zhì)如激素、酶、血漿微量蛋白、血液藥物濃度、微量元素等。這些檢測結(jié)果為臨床上確定診斷、分析病情、調(diào)整治療方案和判斷預(yù)后等提供了有效的實驗依據(jù)。當前第3頁\共有102頁\編于星期五\7點第一節(jié)免疫學(xué)檢驗原理、特點和方法

當前第4頁\共有102頁\編于星期五\7點一、免疫學(xué)檢驗原理（一）抗原抗體反應(yīng)是抗原與相應(yīng)抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可發(fā)生在體內(nèi)，也可發(fā)生在體外。在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)即為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，根據(jù)參與反應(yīng)的抗原的物理性狀（可溶性或顆粒性）以及參與反應(yīng)的條件（電解質(zhì)、補體等）不同，表現(xiàn)出不同的現(xiàn)象，如沉淀、凝集、細胞溶解、補體結(jié)合和毒素中和等。一般將檢查血清中病原微生物抗原和抗體的試驗稱為血清學(xué)試驗。當前第5頁\共有102頁\編于星期五\7點抗原抗體反應(yīng)可分為兩個階段。第一階段為特異性結(jié)合階段，此階段僅需數(shù)秒至數(shù)分鐘，但并不出現(xiàn)可見的反應(yīng)；第二階段為可見反應(yīng)階段，這一階段抗原抗體復(fù)合物在適當?shù)碾娊赓|(zhì)、pH、溫度和補體等的影響下，進一步交聯(lián)聚集，出現(xiàn)凝集、沉淀、溶解和補體結(jié)合介導(dǎo)的生物現(xiàn)象等肉眼可見的反應(yīng)。第二階段反應(yīng)較慢，往往需要數(shù)分鐘至數(shù)小時。這兩個階段不能嚴格劃分，所需的時間也受多種因素的影響。當前第6頁\共有102頁\編于星期五\7點（二）抗原抗體反應(yīng)的特點：1、特異性抗原抗體反應(yīng)的特異性（specificity）是指抗原分子上的抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)結(jié)合的特異性，由這兩個分子之間空間結(jié)構(gòu)的互補性決定的。形同鑰匙與鎖一樣，所以抗原抗體的結(jié)合是有高度特異性的。例如白喉抗抗毒素只能與相應(yīng)的外毒素結(jié)合，而不能與破傷風(fēng)外毒素結(jié)合。因此，在抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)實驗中，可以用已知的抗原或抗體來檢測特定的相對應(yīng)的抗體或抗原。當前第7頁\共有102頁\編于星期五\7點2、比例性比例性（proportionality）是指抗原與抗體特異性結(jié)合反應(yīng)時，生成肉眼可見結(jié)合物的量與反應(yīng)物濃度的關(guān)系，只有當二者濃度比例適當時，才出現(xiàn)可見反應(yīng)?？乖贵w分子比例合適的范圍，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價帶。在此范圍抗原抗體結(jié)合充分，沉淀物形成得快而多。當前第8頁\共有102頁\編于星期五\7點在等價帶的前后，由于抗體和抗原的過量，上清液中可測出游離的抗體或抗原，形成的沉淀物少。當抗體過量時，稱為前帶，抗原過量時稱為后帶。因此，在抗原抗體反應(yīng)的試驗中，如果沒有產(chǎn)生肉眼可見的抗原抗體復(fù)合物出現(xiàn)，一方面要考慮是否有抗原與相應(yīng)的抗體存在，另一方面還必須注意到兩者反應(yīng)的比例是否適當。當前第9頁\共有102頁\編于星期五\7點3、可逆性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體的特性稱為抗原抗體結(jié)合的可逆性（reversibility）。由于抗原抗體的結(jié)合是分子表面的非共價鍵結(jié)合，故形成的復(fù)合物是不牢固的，在一定的條件下可以解離，所以說抗原抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一動態(tài)平衡過程。當前第10頁\共有102頁\編于星期五\7點抗原抗體復(fù)合物解離取決于兩方面的因素：一是抗體對相應(yīng)抗原的親和力；二是環(huán)境因素對復(fù)合物的影響。親和力高的抗體與抗原表位在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離，反之，親和力低的抗體與抗原形成的復(fù)合物較易解離。環(huán)境因素中的過高或過低均可破壞離子間的靜電引力，使抗原抗體的結(jié)合力下降。增加離子強度，也可使靜電引力消失，降低抗原抗體的結(jié)合力，促使其解離。解離后的抗原和抗體仍然保持游離抗原、抗體的生物活性。當前第11頁\共有102頁\編于星期五\7點（三）影響抗原抗體反應(yīng)的因素影響抗原抗體反應(yīng)的因素較多，主要有兩方面：一是反應(yīng)物自身的因素，另一方面是反應(yīng)環(huán)境的因素。當前第12頁\共有102頁\編于星期五\7點1、反應(yīng)物自身因素（1）抗原抗原的理化性狀、表面抗原決定簇的種類和數(shù)目均可影響抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。如顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生凝集現(xiàn)象；可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象；單價抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。當前第13頁\共有102頁\編于星期五\7點（2）抗體①來源來源于不同動物的免疫血清，其反應(yīng)性有差異。家兔等大多數(shù)動物的免疫血清，由于具有較寬的等價帶，與相應(yīng)抗原結(jié)合易出現(xiàn)可見的抗原抗體復(fù)合物。馬、人的免疫血清等價帶窄，抗原不足或過剩，均易形成可溶性復(fù)合物。單克隆抗體一般不適合用于凝集和沉淀反應(yīng)。當前第14頁\共有102頁\編于星期五\7點②濃度抗體的濃度往往是與抗原相對而言，二者合適的濃度才易出現(xiàn)可見的反應(yīng)結(jié)果。③特異性和親和力特異性與親和力是影響抗原抗體反應(yīng)的關(guān)鍵因素，它們共同影響試驗結(jié)果的準確程度。診斷試劑應(yīng)盡可能選高特異性、高親和力的抗體，才能提高試驗的可靠性。當前第15頁\共有102頁\編于星期五\7點2、反應(yīng)的環(huán)境條件（1）電解質(zhì)抗原抗體結(jié)合后，由親水性向疏水性轉(zhuǎn)換過程中必須要有電解質(zhì)參與才能進一步使抗原抗體復(fù)合物表面失去電荷，破壞水化層，使復(fù)合物相互靠攏聚集，形成大塊凝集、沉淀。若無電解質(zhì)存在，則不出現(xiàn)可見反應(yīng)。在抗原抗體反應(yīng)中，通常使用0.85%NaCl溶液或各種緩沖液作抗原抗體的稀釋液及反應(yīng)液。當前第16頁\共有102頁\編于星期五\7點（2）酸堿度抗原抗體反應(yīng)必須在合適的pH環(huán)境中進行，pH過低或過高都會影響抗原抗體的反應(yīng)?？乖贵w反應(yīng)中一般以pH6～9為宜。有補體參與的反應(yīng)pH為7.2～7.4，超過這個范圍會降低補體的酶活性而影響反應(yīng)。當前第17頁\共有102頁\編于星期五\7點（3）溫度抗原抗體反應(yīng)需要合適的溫度才有利于二者結(jié)合。一般以15～40℃為宜，最適溫度為37℃。在此范圍內(nèi)，溫度越高，抗原抗體分子運動越快，碰撞接觸機會越多，兩者結(jié)合反應(yīng)速度越快。但是如果溫度高于56℃，會導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物解離，甚至分子變性。溫度越低，反應(yīng)速度越緩慢，但抗原抗體結(jié)合越牢固，易于觀察。當前第18頁\共有102頁\編于星期五\7點（4）振蕩在抗原抗體反應(yīng)中，適當?shù)恼駬u可促使抗原抗體分子的接觸，加速其反應(yīng)。當前第19頁\共有102頁\編于星期五\7點（四）抗原抗體反應(yīng)的類型隨著免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，在原有經(jīng)典免疫學(xué)實驗方法基礎(chǔ)上，新的免疫學(xué)測定方法不斷出現(xiàn)，使免疫學(xué)實驗技術(shù)更特異、更敏感和更穩(wěn)定。目前根據(jù)抗原和抗體的性質(zhì)不同，反應(yīng)出現(xiàn)的現(xiàn)象和結(jié)果的不同，以及反應(yīng)時參與的其他條件不同，將抗原抗體反應(yīng)分為五種類型。當前第20頁\共有102頁\編于星期五\7點（1）可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的沉淀反應(yīng)；（2）顆?？乖c相應(yīng)抗體結(jié)合發(fā)生的凝集反應(yīng)；（3）抗原抗體結(jié)合后激活補體所產(chǎn)生的溶細胞反應(yīng)；（4）細菌外毒素或病毒與相應(yīng)抗體結(jié)合所致的中和反應(yīng)；（5）標記免疫的抗原抗體反應(yīng)。每種反應(yīng)類型都包括若干實驗技術(shù)。（見抗原抗體反列應(yīng)表1）當前第21頁\共有102頁\編于星期五\7點表1抗原抗體反應(yīng)的類型和試驗方法----------------------------------------------------------------------------------------反應(yīng)類型 實驗方法 結(jié)果判斷---------------------------------------------------------------------------------------沉淀反應(yīng) 液相沉淀實驗 觀察沉淀、檢測濁度 瓊脂凝膠擴散 觀察和測定掃描沉淀線或環(huán) 凝膠電泳技術(shù) 觀察和測定掃描沉淀峰弧等凝集反應(yīng) 直接凝集實驗 用裸眼、放大鏡或顯微鏡觀察紅細胞或膠乳顆粒的凝集現(xiàn)象 間接凝集實驗 同上 凝集抑制實驗 同上 協(xié)同凝集實驗 同上 抗球蛋白實驗 同上---------------------------------------------------------------------------------------當前第22頁\共有102頁\編于星期五\7點----------------------------------------------------------------------------------------補體參與反應(yīng) 補體溶血實驗以裸眼或光電比色儀觀察測定溶血現(xiàn)象 補體結(jié)合實驗 同上中和反應(yīng) 病毒中和實驗 病毒感染性喪失 毒素中和實驗 外毒素毒性丟失標記免疫 熒光免疫技術(shù) 檢測熒光 放射免疫技術(shù) 檢測放射性 酶標免疫檢測酶底物顯色、發(fā)光、熒光 發(fā)光免疫技術(shù) 檢測發(fā)光 金標免疫技術(shù) 觀察金顆沉淀線---------------------------------------------------------------------------------------當前第23頁\共有102頁\編于星期五\7點二、免疫學(xué)檢驗方法和應(yīng)用（一）凝集反應(yīng)顆粒性抗原或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，與相應(yīng)抗體（或抗原）發(fā)生特異性反應(yīng)，在適當電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。凝集試驗應(yīng)用廣而且敏感度高，方法簡便，迄今已成為通用的免疫學(xué)技術(shù)之一，廣泛用于細菌的鑒定和分型、抗原分析、測定抗體和診斷疾病等臨床檢驗。在免疫檢驗技術(shù)中，根據(jù)參與反應(yīng)的顆粒的不同，把凝集反應(yīng)分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。而自身紅細胞凝集反應(yīng)試驗和抗球蛋白參與的凝集試驗是兩種特殊的凝集反應(yīng)。當前第24頁\共有102頁\編于星期五\7點1、直接凝集反應(yīng)：細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原，在適當電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體反應(yīng)，當二者比例適當時，出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng)。反應(yīng)中的抗原稱為凝集原，參與反應(yīng)的抗體稱為凝集素。常用的凝集試驗有玻片法、試管法和微量血凝反應(yīng)板法。當前第25頁\共有102頁\編于星期五\7點（1）玻片凝集試驗：多用于定性。用以知抗體診斷血清與受檢菌液在玻片上混勻，放置數(shù)分鐘后如抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)即出現(xiàn)肉眼可見的凝集反應(yīng)。如沙門菌玻片凝集試驗。（2）試管凝集試驗：多用于半定量和定量試驗，常用已知一定量的抗原（細菌、細胞等）與一系列稀釋的病人血清混合，在保溫放置后觀察結(jié)果，判定受檢血清有無相應(yīng)抗體以及效價，如肥達反應(yīng)。當前第26頁\共有102頁\編于星期五\7點2、間接凝集反應(yīng)：將可溶性抗原（或抗體）先吸附或偶聯(lián)與免疫無關(guān)大小適當?shù)念w粒表面，使之成為致敏載體顆粒，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜的電解質(zhì)存在條件下，出現(xiàn)特異性的凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。其敏感度比直接凝集反應(yīng)高2～8倍，亦明顯高于沉淀反應(yīng)。在臨床上廣泛用于各種抗體和可溶性抗原的檢測。間接凝集反應(yīng)試驗可分為：當前第27頁\共有102頁\編于星期五\7點（1）間接凝集試驗：用抗原致敏載體以檢測標本中的相應(yīng)抗體。將可溶性抗原與載體顆粒結(jié)合，再與樣品中的抗體反應(yīng)，形成肉眼可見的凝集顆粒或凝集塊者為陽性。當前第28頁\共有102頁\編于星期五\7點（2）反向間接凝集試驗：用已知特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應(yīng)抗原。臨床上用于檢測HbsAg、AFP等。當前第29頁\共有102頁\編于星期五\7點（3）間接抑制試驗：試劑為已知抗原致敏的顆粒載體和相應(yīng)的抗體，用于檢測標本中與致敏抗原相同的抗原。檢測方法是將標本與抗體試劑混合反應(yīng)，然后加入致敏載體，若出現(xiàn)凝集，說明標本中不存在相應(yīng)抗原，抗體試劑未被結(jié)合，仍與載體上的抗原反應(yīng)；如未出現(xiàn)凝集，則說明標本中含有相應(yīng)抗原，凝集反應(yīng)被抑制。當前第30頁\共有102頁\編于星期五\7點（4）協(xié)同凝集試驗：其原理同反向間接凝集試驗，但所用的載體是金黃色葡萄球菌，其細胞壁中有A蛋白（SPA），SPA具有能與特異性抗體IgG的Fc段結(jié)合的特性。當這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體，若與相應(yīng)抗原接觸，就會出現(xiàn)反向間接凝集反應(yīng)，常用于細菌、病毒、毒素及可溶性抗原的快速檢測。當前第31頁\共有102頁\編于星期五\7點①間接血凝試驗：是以紅細胞作為載體的間接凝集試驗。可根據(jù)紅細胞凝集的程度判斷陽性反應(yīng)的強弱。在臨床檢測中應(yīng)用廣泛，是經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)之一。②膠乳凝集試驗：是以聚苯乙烯膠乳微粒為載體的間接凝集試驗。③明膠凝集試驗：即以明膠顆粒為載體的間接凝集試驗。常用于血清中抗病毒抗體的檢測。當前第32頁\共有102頁\編于星期五\7點

間接凝集試驗的應(yīng)用間接凝集試驗具有敏感、快速、操作簡便和不需要特殊儀器等優(yōu)點，既可以檢測抗原，又可以檢測抗體。已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗。特別是對某些疾病的診斷治療和效果的觀察有著重要的參考價值。當前第33頁\共有102頁\編于星期五\7點（1）抗體的檢測用于檢測微生物、寄生蟲等感染所產(chǎn)生的抗體及自身抗體和藥物抗體。如檢測沙門菌抗體和類風(fēng)濕因子等。（2）抗原的檢測用于在臨床上用反向間接凝集試驗檢測甲胎蛋白抗原和乙型肝炎病毒流行病學(xué)調(diào)查。在婦產(chǎn)科常用膠乳凝集試驗檢測孕婦尿中的絨毛膜促性腺激素（HCG）抗原。以診斷早期妊娠。當前第34頁\共有102頁\編于星期五\7點（二）沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當?shù)臈l件下發(fā)生特異性結(jié)合而產(chǎn)生沉淀的現(xiàn)象。沉淀反應(yīng)中的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖等可溶性物質(zhì)?？乖c相應(yīng)抗體再介質(zhì)中或固相表面發(fā)生特異性結(jié)合，可分為兩個階段，第一階段為抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，在幾秒或幾十秒內(nèi)就可完成，出現(xiàn)可溶性小附和物，十分快速，但肉眼不可見。在免疫比濁法中可以測定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率比濁法。第二階段則形成大的可見的免疫復(fù)合物，需要幾十分鐘到數(shù)小時才能完成。如沉淀線或沉淀環(huán)。沉淀反應(yīng)的常用試驗方法有：當前第35頁\共有102頁\編于星期五\7點1、液體內(nèi)沉淀試驗（1）絮狀沉淀試驗：將抗原和抗體溶液混合在一起，在電解質(zhì)存在下，抗原與抗體結(jié)合形成絮狀沉淀物。（2）免疫濁度測定：是將光學(xué)測量儀器與分析檢測系統(tǒng)相結(jié)合應(yīng)用于沉淀反應(yīng)，對各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物及其它小分子半抗原物質(zhì)進行定量測定的方法。當前第36頁\共有102頁\編于星期五\7點其原理是：當可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當比例結(jié)合時，在特殊緩沖液中快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。采用透射比濁或散射比濁的方法，根據(jù)所測的吸光度值可推算出待測抗原的量。免疫濁度測定又可分為速率比濁法和終點比濁法。其優(yōu)點是可以準確定量，校正曲線比較穩(wěn)定，簡便快捷，無污染，易于自動化，也適合于大批量標本的檢測，在臨床檢驗中得到了廣泛應(yīng)用。當前第37頁\共有102頁\編于星期五\7點2、凝膠內(nèi)沉淀試驗：利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例適當?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的方式和特性，發(fā)展為以下幾種實驗技術(shù)：（1）單向擴散試驗：在瓊脂凝膠中混入一定量的抗體，使待測抗原溶液從局部向瓊脂內(nèi)自由擴散，在一定區(qū)域內(nèi)形成可見的沉淀環(huán)。當前第38頁\共有102頁\編于星期五\7點（2）雙向擴散試驗：在瓊脂內(nèi)抗原和抗體各自向?qū)Ψ綌U散，在最適當?shù)谋壤幮纬煽乖贵w沉淀線，觀察沉淀線的位置、形狀及對比關(guān)系，可作抗原和抗體的定性分析。（3）免疫電泳技術(shù)：是將瓊脂內(nèi)電泳與免疫擴散相結(jié)合的一種常用的一種免疫學(xué)實驗方法。有對流免疫電泳、火箭電泳、交叉免疫電泳、免疫電泳、固相免疫電泳等實驗技術(shù)。當前第39頁\共有102頁\編于星期五\7點（三）補體結(jié)合試驗：是經(jīng)典途徑的抗原抗體反應(yīng)之一，應(yīng)用綿羊紅細胞和溶血劑作指示劑，建立了檢測抗原抗體與補體結(jié)合的方法，如檢測梅毒的華氏試驗（現(xiàn)已被淘汰）。凡是能激活補體的IgG、IgM類抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合的反應(yīng)都可以用本法檢測。目前主要用于病毒性傳染病診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及一些自身抗體、腫瘤相關(guān)抗原等的檢測。當前第40頁\共有102頁\編于星期五\7點（四）免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)是將多種可以微量或超微量檢測的示蹤物（如熒光素、放射性核素、酶、化學(xué)或生物發(fā)光劑）對抗原或抗體進行標記，制成標記物，加入抗原抗體反應(yīng)體系中與相應(yīng)未標記抗體或抗原進行反應(yīng)，使免疫反應(yīng)結(jié)果可被靈敏地進行分析測定?？梢圆粶y定免疫復(fù)合物本身，僅對其中的標記物進行測定就可確定待測物質(zhì)的含量。因此，免疫標記技術(shù)具有高度特異性和高度敏感性，由于它具有重復(fù)性好、準確性高、操作簡便、易于商品化和自動化的特點，現(xiàn)已發(fā)展成為生物活性物質(zhì)分析重要的方法之一。當前第41頁\共有102頁\編于星期五\7點1、放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)是利用放射性核素的靈敏性和精確性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合而創(chuàng)建的一類免疫測定技術(shù)。常用的放射性核素有125I和131I等，主要有兩種基本類型：（1）放射免疫分析：是最經(jīng)典的模式，是以放射性核素標記的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標記的抗原競爭特異性抗體為基本原理來測定抗原含量的分析方法。（2）免疫放射分析：是用放射性核素標記的過量抗體方法?？贵w與待測抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標記抗體的非競爭放射免疫分析。當前第42頁\共有102頁\編于星期五\7點放射免疫技術(shù)由于其測定的靈敏度高，特異性強、精密度好，而且可對抗原和半抗原進行測定，對儀器設(shè)備條件要求不高，所以廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗。常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。其缺點是：放射性污染和危害；常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期短、不易快速及自動化檢驗等，已逐步被其它標記免疫分析方法所取代。當前第43頁\共有102頁\編于星期五\7點2、熒光免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性結(jié)合起來的一種方法，是最早發(fā)展的一種免疫標記技術(shù)。其原理是利用熒光素標記抗體，使之在涂片上或組織切片上與標本的待測抗原特異性地結(jié)合，采用高發(fā)光效率的點光源，透過濾光板發(fā)出一定波長的光，使結(jié)合在標本上的熒光素被激發(fā)而產(chǎn)生熒光，然后借助熒光顯微鏡觀察底物片上的熒光染色形態(tài)，判斷待測抗原或抗體。當前第44頁\共有102頁\編于星期五\7點熒光免疫技術(shù)在臨床檢驗上常用作細菌、病毒和寄生蟲的檢驗以及自身抗體的檢測。免疫熒光間接染色法可用于測定血清中的抗體，如免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測是梅毒特異性診斷方法之一。間接免疫熒光試驗是當前公認的最有效的檢測瘧疾抗體的方法。當前第45頁\共有102頁\編于星期五\7點3、酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)是經(jīng)典標記免疫技術(shù)之一，是以酶標記抗體或抗原為主要試劑的一種標記免疫分析技術(shù)。酶免疫技術(shù)是利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用，提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)檢測敏感性的一種標記免疫技術(shù)。臨床常用的酶免疫技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附試驗（見第三章第3節(jié)）當前第46頁\共有102頁\編于星期五\7點酶免疫測定除具有高度的敏感性和特異性，酶標記試劑比較穩(wěn)定，而且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，因此發(fā)展迅速。市場上各種符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包被好的的固相載體、酶標記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動或半自動檢測儀上不斷研究發(fā)明問世，極大地促進了酶免疫測定技術(shù)的普及。特別是固相載體酶免疫技術(shù)與膠體金技術(shù)等的結(jié)合，使市場上出現(xiàn)了一大批適用于家庭及床旁檢測的快速試劑盒，大大方便了人群的自我保健和臨床的快速診斷。ELISA則應(yīng)用更為廣泛，幾乎所有的可溶性抗原抗體系統(tǒng)均可用以檢測。當前第47頁\共有102頁\編于星期五\7點該技術(shù)的檢測靈敏度高、特異性強、準確性好，酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定，檢測方法簡便安全易行，而且容易與其他技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法等。因此，酶免疫技術(shù)在方法學(xué)上的研究重點除與其他標記免疫技術(shù)一樣需制備高純度抗原和高親和力的特異性抗體外，還包括：選擇高活性的純化標記用酶；試驗有效的交聯(lián)試劑和交聯(lián)反應(yīng)，制備高質(zhì)量的酶標記物；選用適宜的酶作用底物系統(tǒng)；確定有效的分離結(jié)合/游離反應(yīng)物的方法；篩選操作步驟以及研究自動化測定技術(shù)等。當前第48頁\共有102頁\編于星期五\7點4、金標免疫技術(shù)是以膠體金為標記物的免疫標記技術(shù)。（見第三章第4節(jié)）當前第49頁\共有102頁\編于星期五\7點第二節(jié)

免疫膠乳試驗及應(yīng)用

當前第50頁\共有102頁\編于星期五\7點一、膠乳凝集試驗原理及方法（一）原理：膠乳凝集試驗是以聚苯乙烯膠乳顆粒為載體的間接凝集試驗。使用抗原或抗體致敏膠乳顆粒，再用此致敏膠乳檢測相應(yīng)的抗體或抗原。膠乳凝集試驗所用的膠乳顆粒是人工合成的載體，均一性較好，性能比紅細胞穩(wěn)定，但與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力及凝集性能不如紅細胞，因此膠乳凝集試驗敏感性不如血凝試驗。當前第51頁\共有102頁\編于星期五\7點（二）

試驗方法：1、膠乳凝集試驗：在反應(yīng)板的一格中，先加受檢標本一滴，再加致敏膠乳一滴，連續(xù)搖動2～3min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陽性。不凝集者為陰性。同時作陰、陽性對照。2、膠乳凝集抑制試驗：先加受檢標本一滴，再加一滴相應(yīng)抗血清混勻，再加一滴致敏膠乳抗原，連續(xù)搖動2～3min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陰性，不凝集者為陽性。當前第52頁\共有102頁\編于星期五\7點（三）

注意事項：1、受檢標本和試劑的加入順序應(yīng)遵照規(guī)定的步驟，否則無法判定結(jié)果。2、試劑一般保存在4～6℃較為適宜，膠乳試劑不能冷凍，試驗前取出待接近室溫時的溫度再使用。3、此試驗一般作定性檢測，嚴格的操作也能達到半定量的要求。滴加標本和試劑時，液滴大小應(yīng)均勻一致，每滴約50μl。當前第53頁\共有102頁\編于星期五\7點二、抗鏈球菌溶血素“O”的測定（一）試驗原理：在受檢者血清標本中，加入適量的溶血素“O”。如標本中含有高單位抗體，中和后則有多余的抗體存在，與溶血素“O”致敏的膠乳試劑反應(yīng)，可出現(xiàn)清晰而均勻的凝集顆粒。當前第54頁\共有102頁\編于星期五\7點（二）

試驗步驟：1、將溶血素“O”貯存液用生理鹽水稀釋到每ml含5和2.5結(jié)合單位的兩種了應(yīng)用液。2、血清標本56℃30min滅活后用生理鹽水作1：50稀釋。3、在膠乳試驗反應(yīng)板上滴入稀釋血清標本1滴，再滴加2.5結(jié)合單位應(yīng)用液1滴，輕輕搖動3min，使其均勻。4、滴加ASO膠乳1滴，輕輕搖動8min，有清晰凝集者為陽性。5、將陽性血清用5結(jié)合單位應(yīng)用液重復(fù)試驗，有清晰凝集者為強陽性。當前第55頁\共有102頁\編于星期五\7點（三）

臨床意義1、陰性者≤250u，陽性者ASO在330～500u，強陽性者ASO在625u以上。2、正常健康人ASO水平隨地區(qū)、年齡、氣候、季節(jié)、環(huán)境條件不同而異，通常成人在250u以內(nèi)，3歲以下兒童在100u以內(nèi)者均屬正常。3、A群溶血性鏈球菌感染后，80%～85%的患者ASO升高。3～5周達最高值，兩個月后開始下降，6～12個月恢復(fù)到正常水平。用于診斷急性風(fēng)濕熱和慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。當前第56頁\共有102頁\編于星期五\7點（四）注意事項：1、患者標本應(yīng)新鮮，如被細菌污染或嚴重溶血者，可影響結(jié)果，引起假陽性。2、高血脂標本，試管或試劑被膽固醇污染均可出現(xiàn)假陽性。3、所用器具應(yīng)清潔，取量要準確。當前第57頁\共有102頁\編于星期五\7點4、溶血素“O”單位標定不準，?？捎绊懡Y(jié)果。每次試驗應(yīng)取一個已知的ASO單位的標本為對照，如出現(xiàn)偏高或偏低的結(jié)果，應(yīng)重新測定溶血素“O”的結(jié)合量。5、鏈球菌溶血素“O”在pH6.5時活性最強，偏酸或偏堿均可影響結(jié)果。6、膠乳試劑不可冰凍，放置4℃冰箱可保存一年。不同膠乳商品試劑有不同要求，操作前應(yīng)仔細閱讀說明書。當前第58頁\共有102頁\編于星期五\7點三、類風(fēng)濕因子RF的檢測類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是由自身抗體-免疫復(fù)合物引起的自身免疫性疾病。多發(fā)于青壯年，女性多于男性。患者由于感染、炎癥等原因產(chǎn)生了變性IgG。變性IgG成為自身抗原，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了各種抗變性IgG抗體，即類風(fēng)濕因子RF。變性IgG與類風(fēng)濕因子結(jié)合，形成中等大小的免疫復(fù)合物，沉積于關(guān)節(jié)等部位，激活補體，引起慢性漸進性免疫炎癥性損害，嚴重時可累及心、肺和血管等，免疫學(xué)檢查血清和關(guān)節(jié)滑膜液中出現(xiàn)類風(fēng)濕因子。當前第59頁\共有102頁\編于星期五\7點（一）試驗原理：膠乳凝集法，將熱凝聚IgG包被于聚苯乙烯膠乳顆粒表面，如待測血清中含有RF，與相應(yīng)抗原結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。（二）試驗步驟：按試劑盒說明書操作，待測血清預(yù)先56℃30min滅活，再用0.1mol/L，pH8.2甘氨酸緩沖液作1：20～1：80稀釋，取各稀釋度血清一滴，加于反應(yīng)板上，滴加RF膠乳試劑一滴，充分混勻并輕輕搖動反應(yīng)板，3min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性，當前第60頁\共有102頁\編于星期五\7點（三）臨床意義正常人用本法檢測常為陰性。陽性主要見于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。另外，干燥綜合征、冷球蛋白血癥、亞急性細菌性心內(nèi)膜炎、肝硬化、慢性肝炎等疾病也可陽性。因此RF對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者并不具有嚴格的特異性，RF陽性不能作為診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的惟一標準。盡管在多種疾病RF可陽性，但是滴度均較低，隨RF滴度增加。對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷特異性也增高。多種疾病RF測定陽性率如表2。當前第61頁\共有102頁\編于星期五\7點表2多種疾病RF測定陽性率-----------------------------------------------疾病RF測定陽性率-----------------------------------------------類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎79.6%系統(tǒng)性紅斑狼瘡30%干燥綜合征95%皮肌炎80%硬皮病80%混合性結(jié)締組織病25%-----------------------------------------------當前第62頁\共有102頁\編于星期五\7點注意事項：本法檢測出陽性主要為IgM類RF，陽性血清可連續(xù)雙倍稀釋測效價。每次試驗均應(yīng)設(shè)陰、陽性對照。其它見膠乳凝集法注意事項。當前第63頁\共有102頁\編于星期五\7點第三節(jié)

酶聯(lián)免疫技術(shù)及應(yīng)用

當前第64頁\共有102頁\編于星期五\7點一、酶免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)是以酶標記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標記免疫技術(shù)中使用最廣泛的一種方法，具有靈敏度高、特異性強、酶標記物有效期長等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗和生物學(xué)的各個領(lǐng)域。當前第65頁\共有102頁\編于星期五\7點（一）原理和分類酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)，它具有高效性和專一性的特點。酶免疫分析技術(shù)是將酶的催化放大作用和抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標記抗原或抗體后，既不影響抗原或抗體免疫反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。免疫反應(yīng)進行以后，酶還能催化相應(yīng)的底物顯色，最后利用酶標儀檢測顏色的深淺來進行定性或定量分析。顯色反應(yīng)顯示酶的存在，表示結(jié)合或游離的酶標抗原或抗體的量的變化。當前第66頁\共有102頁\編于星期五\7點根據(jù)反應(yīng)過程中是否將結(jié)合的酶標記物和游離的酶標記物分離，把酶免疫分析技術(shù)分為兩類：非均相酶免疫測定和均相酶免疫測定。非均相酶免疫測定抗原抗體反應(yīng)平衡后，將游離的酶標記物和與抗原抗體結(jié)合的酶標記物分離開，再通過底物顯色進行測定。其代表技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。而均相酶免疫測定由于免疫反應(yīng)后酶活性的改變，不需將游離的和結(jié)合的酶標記物分開。主要用于小分子物質(zhì)的測定。當前第67頁\共有102頁\編于星期五\7點（三）常用的標記酶和底物（1）辣根過氧化物酶（HRP）其分子量較小，溶解性好，易于提取，來源廣泛；酶和酶標記物性質(zhì)穩(wěn)定，耐熱、耐有機溶劑作用，易于保存，價格低廉；易于標記，標記后活性損失很小。因此HRP是ELISA中應(yīng)用最廣的標記用酶。當前第68頁\共有102頁\編于星期五\7點HRP底物種類很多，主要有鄰苯二胺（OPD）和四甲基聯(lián)苯胺（TMB），前者由于顯色不穩(wěn)定，對機體有一定致癌性，已逐漸被TMB所替代。（2）堿性磷酸酶（ALP）和酶底物（3）β-半乳糖苷酶（β-Gal）和酶底物，常用于均相免疫測定。當前第69頁\共有102頁\編于星期五\7點（四）固相載體除均相酶免疫測定外，各種酶免疫測定最后都需要分離結(jié)合的酶標記物和游離的酶標記物。固相抗體（抗原）是最有效和簡便的分離方法，因此抗體（抗原）固相載體是固相酶免疫測定必不可少的組成成分。當前第70頁\共有102頁\編于星期五\7點（1）塑料制品：抗體或蛋白質(zhì)抗原可通過非共價或物理吸附機制結(jié)合到塑料制品表面，材料經(jīng)濟、方法簡便，目前，聚苯乙烯微量反應(yīng)板是ELISA常用的固相載體。（2）免疫微球：由聚苯乙烯材料制成的塑料微球或顆粒，其直徑常為微米或毫米，塑料微球與抗原或抗體偶聯(lián)后，結(jié)合容量大，可以均勻地分散到整個溶液中，極大地增加了反應(yīng)面積，因此反應(yīng)速度快，洗滌、分離也方便。當前第71頁\共有102頁\編于星期五\7點（3）微孔濾膜載體：是一種多孔性薄膜過濾材料，如醋酸纖維素膜、玻璃纖維素膜和尼龍膜等。廣泛應(yīng)用于定性或半定量斑點ELISA、免疫金標滲濾試驗等。當前第72頁\共有102頁\編于星期五\7點（五）免疫吸附劑是指于固相載體結(jié)合的抗原或抗體。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。目前廣泛使用的聚苯乙烯固相載體多采用吸附方式包被抗原或抗體。

當前第73頁\共有102頁\編于星期五\7點二、酶聯(lián)免疫吸附試驗（一）原理和類型酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）就是以酶作為標記物、以免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測定方法。ELISA測定試劑主要包括固相包被的抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體和酶反應(yīng)的底物等。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體保持其免疫學(xué)活性，抗原或抗體的酶結(jié)合物既保留其免疫學(xué)活性，有保留酶的活性。當前第74頁\共有102頁\編于星期五\7點在測定過程中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進行，用洗滌的方法使固相載體形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，反應(yīng)結(jié)果是以酶與底物作用后顯色來判斷的。顯色的深淺與臨床標本中待測物的濃度成正比或反比關(guān)系。所以可以根據(jù)顯色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，可極大地放大反應(yīng)結(jié)果，從而使檢測方法達到很高的敏感度。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：當前第75頁\共有102頁\編于星期五\7點1、雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合抗體及雜質(zhì)。（2）加待測標本，與固相抗體接觸反應(yīng)一段時間，標本讓中的抗原與固相抗體結(jié)合（孵育），形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其它未結(jié)合物質(zhì)。當前第76頁\共有102頁\編于星期五\7點（3）加酶標抗體。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合（孵育）。形成固相抗體-抗原-酶標抗體免疫復(fù)合物。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時，固相載體上帶有的酶量與標本中待測抗原的量相關(guān)。（4）加底物顯色。復(fù)合物上的酶催化底物生成有色產(chǎn)物根據(jù)顯色的深淺可進行該抗原的定性或定量（酶標儀比色或比濁）。當前第77頁\共有102頁\編于星期五\7點在臨床檢驗中，雙抗體夾心法適用于檢測各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HbsAg）、甲胎蛋白（AFP）、絨毛膜促性腺激素（HCG）等。不能用于半抗原等小分子的測定。當前第78頁\共有102頁\編于星期五\7點2、間接法測抗體間接法是檢測抗體常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體（即酶標二抗）檢測已與固相抗原結(jié)合受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合抗原及雜質(zhì)（2）加稀釋的受檢血清。血清中的特異性抗體與固相抗原結(jié)合（孵育），形成固相抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下抗原抗體復(fù)合物。其它免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。當前第79頁\共有102頁\編于星期五\7點（3）加酶標記的抗免疫球蛋白（酶標抗抗體）。它與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合（孵育），形成固相抗原-受檢抗體-酶標二抗復(fù)合物，從而使該抗體間接標記上酶。清洗后，固相載體上的酶量與標本中待測特異性抗體的量相關(guān)。（4）加底物顯色。顯色的深淺與標本中待測特異性抗體的量相關(guān)（比色或比濁）。當前第80頁\共有102頁\編于星期五\7點此法主要用于對病原體抗體的檢測來進行傳染病的診斷。主要缺點是待測標本需要經(jīng)過稀釋后才能進行測定，否則血清中高濃度的非特異性IgG和其它干擾物質(zhì)回引起陰性本底過高，造成假陽性。

當前第81頁\共有102頁\編于星期五\7點3、雙抗原夾心法測抗體反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原包被固相載體和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。此法待測標本不需稀釋，可直接用于測定，故其敏感度高于間接法。臨床檢驗中，抗-HBs的檢測常用此法。當前第82頁\共有102頁\編于星期五\7點4、競爭法測抗體其原理為待測標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標本中的抗體含量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗體越少，因此，陽性結(jié)果顯色程度要淺于陰性結(jié)果。如抗-HBc的檢測常用此法。當前第83頁\共有102頁\編于星期五\7點5、捕獲法捕獲法（亦稱反向間接法）ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。競爭法測抗體一般僅適用于檢測IgG型抗體，IgM型抗體的檢測用于傳染病的早期診斷，如果用競爭法，即酶標記的抗人IgM作為酶標二抗進行間接ELISA測定，這樣標本中同時存在的不同濃度的IgG型抗體將與IgM抗體競爭，使結(jié)合在固相抗原上的IgM抗體相應(yīng)減少。另外，標本中如含有類風(fēng)濕因子，也會產(chǎn)生干擾。當前第84頁\共有102頁\編于星期五\7點因此一般間接法測定IgM抗體不能得到準確的結(jié)果。而捕獲法是用抗人IgM抗體包被固相載體，以捕獲待測血清中的IgM，然后加入抗原，此抗原只于特異性的IgM結(jié)合，繼續(xù)加入酶標記的特異性抗體，最后與底物作用，顯色深淺與標本中特異性的IgM成正比。捕獲法常用于病毒性感染的早期診斷，如甲型肝炎病毒（HAV）IgM抗體的檢測。當前第85頁\共有102頁\編于星期五\7點6、其他ELISA如應(yīng)用生物素-親和素放大系統(tǒng)的ELISA，利用酶催化底物發(fā)熒光的酶聯(lián)免疫熒光測定（ELFIA），以及酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光測定（ELICLA）等。新方法不僅進一步提高了測定靈敏度、特異性，而且使ELISA技術(shù)在提高自動化程度的同時，也便于單份樣本測定，尤其適用于急診、社區(qū)診所及家庭化驗。當前第86頁\共有102頁\編于星期五\7點第四節(jié)金標記免疫分析技術(shù)

當前第87頁\共有102頁\編于星期五\7點金標記免疫分析技術(shù)是一種以膠體金作為示蹤物，用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型標記免疫測定技術(shù)，在20世紀70年代初期始創(chuàng)。由于膠體金能與多種生物大分子結(jié)合，已成為繼熒光素、放射性核素和酶之后在免疫標記技術(shù)中常用的一種非放射性核素示蹤物。由于它使用簡便、快速，所以已廣泛應(yīng)用于臨床檢驗工作中。膠體金與免疫活性物質(zhì)（抗原或抗體）的結(jié)合物，又稱膠體金標記物。當前第88頁\共有102頁\編于星期五\7點一、膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金是氯金酸在還原劑作用下，聚合成一定大小的金顆粒，并形成帶負電的疏水溶液，由于靜電作用而形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。二、膠體金的性狀（一）膠體金的穩(wěn)定性膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒均勻地、穩(wěn)定地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液，因而具有膠體的多種特性，特別是對電解質(zhì)的敏感性。當前第89頁\共有102頁\編于星期五\7點（二）膠體金呈色性不同大小的膠體金呈色有一定的差別。最小的膠體金（2～5nm）是橙黃色的；中等大小的膠體金（10～20nm）是酒紅色的；較大顆粒的膠體金（30～80nm）則是紫紅色的。根據(jù)這一特點，用肉眼觀察膠體金的顏色可粗略估計金顆粒的大小。（三）

光吸收性膠體金在可見光范圍內(nèi)有一單一光吸收峰，這個吸收峰的波長（λmax）在510～550nm范圍內(nèi)，隨膠體金顆粒大小而變化。當前第90頁\共有102頁\編于星期五\7點三、膠體金免疫測定技術(shù)（一）斑點金免疫滲濾試驗1、原理斑點金免疫滲濾試驗（DIGFA）是以硝酸纖維素薄膜（NC膜）為固相載體，將抗體（或抗原）點加固定在上面，當待測標本滴加在膜上時，標本中所含的抗原被膜上抗體捕獲，其后加入膠體金標記的抗體，它與已結(jié)合在膜上的抗原發(fā)生反應(yīng)，形成固相抗體-抗原-膠體金標記抗體復(fù)合物，因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點。當前第91頁\共有102頁\編于星期五\7點2、雙抗體夾心法操作和反應(yīng)步驟（1）將標記有抗體濾膜片的扁平塑料小盒打開，平放于實驗臺面上，在塑料小孔內(nèi)滴加含待測抗原在標本1～2滴，待完全滲入盒內(nèi)。（2）在小孔內(nèi)滴加膠體金標記抗體試劑1～2滴，待完全滲入盒內(nèi)。（3）

在小孔內(nèi)滴加洗滌液2～3滴，待完全