演示文稿環(huán)介導等溫擴增技術原理當前第1頁\共有19頁\編于星期四\9點（優(yōu)選）環(huán)介導等溫擴增技術原理當前第2頁\共有19頁\編于星期四\9點主要內容等溫擴增技術簡介等溫擴增技術的應用前景幾種等溫擴增技術比較環(huán)介導的等溫擴增技術原理環(huán)介導的等溫擴增演示環(huán)介導的等溫擴增檢測當前第3頁\共有19頁\編于星期四\9點等溫擴增的概念等溫擴增技術(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸體外擴增技術，其反應過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物（或不加）來達到快速核酸擴增的目的。與PCR技術相比核酸等溫擴增對儀器的要求大大簡化，反應時間大大縮短，更能滿足快速簡便的需求。當前第4頁\共有19頁\編于星期四\9點等溫擴增的優(yōu)勢應用特異性高分析速度快成本低突變率低不需要升溫降溫過程，一臺的加熱器即可操作檢測核酸成分比檢測微生物本身危險性小方便診斷當前第5頁\共有19頁\編于星期四\9點等溫擴增的種類環(huán)介導核酸等溫擴增技術（LAMP）滾環(huán)擴增技術RCA單引物等溫擴增SPIA依賴解旋酶的等溫擴增技術HAD鏈替代擴增SDA交叉引物擴增技術CPA核酸依賴性擴增檢測技術NASBAQβ復制酶反應當前第6頁\共有19頁\編于星期四\9點各類等溫擴增技術的比較溫度℃引物模板其他NASBA42需要2條RNA反轉錄酶，RNA酶H，T7RNA聚合酶SPIA421條RNA反轉錄酶，T7RNA聚合酶HDA37/65需要2條DNA解旋酶，擴增片段小SDA37/65不需要DNALAMP634條DNADNA聚合酶RCA37-65需要DNAQβ37不需要RNA當前第7頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導等溫擴增核酸技術優(yōu)勢LAMP克服了傳統(tǒng)PCR反應需要通過反復熱變性獲得單鏈模板的缺點，避免了反復升降溫的過程，實現(xiàn)了恒溫條件下的連續(xù)快速擴增，具有更高的靈敏度和擴增效率。操作簡單：只需一個水浴鍋快速高效：不需要預先的雙鏈DNA熱變性．避免了溫度循環(huán)而造成

的時間損失特異性強：針對靶序列6個區(qū)域設計的4種特異性引物。6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增。故其特異性極高。

高靈敏度，對于病毒擴增模板可達幾個拷貝，比PCR高出數(shù)量級的差異。缺點：由于LAMP擴增是鏈置換合成，靶序列長度最好在300

bp以內。>500

bp則較難擴增。故不能進行長鏈DNA的擴增。靈敏度高易造成假陽性結果。當前第8頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導等溫擴增核酸技術環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediatedisothermalamplification,簡稱LAMP)是利用4個特殊設計的引物和具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶,在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA的新技術。LAMP技術以其特異性強、靈敏度高、快速、準確和操作簡便等優(yōu)點在核酸的科學研究、疾病的診斷和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。當前第9頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導等溫擴增原理60—65℃是雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)。利用引物合成的DNA鏈取代模板互補鏈。①擴增目的片段時依賴的是一種具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶②需四條能夠識別靶序列六個特異區(qū)域的引物③LAMP法并不需要對雙鏈DNA進行預變性及進行溫度循環(huán)。

當前第10頁\共有19頁\編于星期四\9點針對靶基因的六個不同的區(qū)域，基于靶基因3’端的F3c、F2c和Flc區(qū)以及5’端的Bl、B2和B3區(qū)等6個不同的位點設計4種引物。LAMP反應的開始階段四條引物都被使用，但在循環(huán)階段則只有內引物被使用。FIP(ForwardInnerPrimer)：上游內部引物，由F2區(qū)和F1C區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3’端的F2c區(qū)域互補，F(xiàn)1C區(qū)與靶基因5’端的Flc區(qū)域序列相同。F3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補。BIP引物：下游內部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補，B1C域與靶基因5’端的Blc區(qū)域序列相同。B3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補。環(huán)介導等溫擴增引物設計當前第11頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導等溫擴增引物設計LAMP反應引物與對應模板區(qū)域當前第12頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導的等溫擴增技術原理內引物FIP的F2與其模板的互補序列F2c結合，在BstDNA聚合酶作用下，從F2的3’末端開始啟動DNA合成，合成一條以FIP為新的DNA單鏈并與模板鏈結合形成新的雙鏈DNA。當前第13頁\共有19頁\編于星期四\9點

環(huán)介導的等溫擴增技術原理以F3為起始合成的新鏈與模板鏈形成雙鏈。而原合成的以FIP為起始的DNA單鏈被置換而脫離產生一單鏈DNA，其在5’末端F1c和F1區(qū)發(fā)生自我堿基配對，形成莖環(huán)狀結構。

當前第14頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導的等溫擴增技術原理引物BIP的B2與模板鏈B2c區(qū)互補配對，合成以BIP為起始的新鏈，并與模板鏈互補形成DNA雙鏈。同時，F(xiàn)端的環(huán)狀結構將被打開，外引物B3與模板上B3c雜交后，以其3’末端為起點也開始合成新鏈，并使以BIP為起始的DNA單鏈從模板鏈上脫離下來，形成以FIP和BIP為兩端的單鏈。因為B1C與B1互補，F(xiàn)1C與F1互補，兩端自然發(fā)生堿基配對，這條游離于液體中的DNA單鏈分別在F和B末端形成兩個莖環(huán)狀結構，于是整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀結構，此結構即為LAMP的基礎結構。形成LAMP基礎結構當前第15頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導的等溫擴增技術原理當前第16頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導等溫擴增過程演示當前第17頁\共有19頁\編于星期四\9點反應時間對LAMP的影響喬巖梅.

炭疽芽孢桿菌特征基因恒溫擴增檢測方法的研究[D].

中國科學院研究生院（武漢病毒研究所）

2007EffectofreactiontimeontheLAMPreaetion.Lanes1,DNAmarker(DL2000)with2000,1000,750,500,250and100bP:lanes2一5,LAMPamPlificationProduetsfor15min,30min,45min,60min,respectively:lane6,withoutDNAtemplateinthereaction.當前第18頁\共有19頁\編于星期四\9點環(huán)介導等溫擴增檢測反應結束后對擴增產物的檢測常使用焦磷酸酶沉淀檢測（濁度檢測）、熒光檢測、凝膠電泳檢測等。

焦磷酸酶沉淀的檢測（濁度檢測）：在LAMP反應過程中，dNTP析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的Mg2+結合，產生副產物焦磷酸酶白色沉淀，研究者發(fā)現(xiàn)LAMP反應中焦磷酸鎂沉淀的形成與所產生的DNA量之間的關系，發(fā)現(xiàn)兩者生成量之間呈線性關系，并且焦磷酸鎂沉淀在400nm處有吸收峰，從而