高效液相色譜法(HPLC)

HighPerformanceLiquidChromatography第一節(jié)概述一、高效液相色譜法及其特點(diǎn)1.高效液相色譜法（HPLC）：以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，發(fā)展而成的分離分析方法。2.高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法、氣相色譜法的區(qū)別（1）與經(jīng)典液相色譜法的比較

經(jīng)典柱色譜法分離過(guò)程裝載樣品裝載溶劑重力洗脫玻璃柱硅膠氧化鋁纖維素濾網(wǎng)1050100150Volume(mL)Time(hr)1.02.03.04.0普通規(guī)格固定相常壓輸送流動(dòng)相色譜柱一次使用離線(xiàn)檢測(cè)高效液相色譜法分離過(guò)程進(jìn)樣口檢測(cè)器色譜圖色譜柱溶劑高壓泵混合器高壓輸送流動(dòng)相高效固定相在線(xiàn)檢測(cè)色譜柱多次使用高靈敏檢測(cè)器差別：主要在于固定相的性質(zhì)、形狀及粒度，其次是檢測(cè)手段和輸液設(shè)備。經(jīng)典液相色譜固定相：粒度：60～600μm（多孔）柱長(zhǎng)：10～200cm（d=10~50mm）n約為2～50/m

流動(dòng)相：靠重力輸送經(jīng)典液相色譜無(wú)在線(xiàn)檢測(cè)器缺點(diǎn)：（1）粒度范圍寬、不規(guī)則，不易填充均勻，擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力大。（2）無(wú)檢測(cè)設(shè)備，分析速度慢、效率低。

只能做為分離手段高效液相色譜法固定相：5～20μm，球形。流動(dòng)相：高壓泵輸液。檢測(cè)器：在線(xiàn)檢測(cè)。（2）高效液相色譜與氣相色譜的比較氣相色譜法分離過(guò)程1.載氣瓶2.壓力調(diào)節(jié)器3.凈化器4.穩(wěn)壓閥5.柱前壓力表6.流量計(jì)7.進(jìn)樣器8.色譜柱9.柱溫箱10.餾分收集口11.檢測(cè)器12.檢測(cè)器恒溫箱13.記錄裝置14.尾氣出口HPLC與GC的差別：主要在于做為流動(dòng)相的液體和氣體性質(zhì)之間的差別，其次是操作條件和分析對(duì)象的差別。流動(dòng)相GC:惰性氣體，與組分分子間無(wú)作用力。只起運(yùn)載組分的作用。HPLC:各種液體，與組分分子間有作用力，同時(shí)與固定相展開(kāi)對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)，對(duì)分離起很大作用。分析對(duì)象GC:柱溫下具有足夠揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的物質(zhì)、氣體或沸點(diǎn)較低的化合物。操作條件溫度：GC:一定柱溫下進(jìn)行分離。

HPLC:通常室溫下進(jìn)行分離。檢測(cè)器：GC:TCD、FID、ECD、FPD和NPDHPLC:UV、DAD、FD、RID········3.高效液相色譜法的特點(diǎn)（1）分離效能高（2）選擇性高（3）靈敏度高（4）分析速度快（5）應(yīng)用范圍廣二、高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用

色譜法具有分離分析兩種功能，因此在藥物分析中，HPLC已成為對(duì)各類(lèi)藥物及其制劑進(jìn)行鑒別、檢查、雜質(zhì)分離及含量測(cè)定的主要手段。中國(guó)藥典：1953～2005年共出版發(fā)行七版滴定分析：各版均占50％以上。UV:用于含量測(cè)定、含量均勻度或溶出度測(cè)定。IR：用于原料藥鑒別（2000版444個(gè)品種）85版開(kāi)始收載HPLC法－7項(xiàng)90版－76項(xiàng)；2000版200多項(xiàng)；2005版－1000多項(xiàng)

美國(guó)藥典委員會(huì)（USPC）成立于1820年，至今近200年。出版發(fā)行了25版藥典。75年（19版）將HPLC載入藥典20版－62項(xiàng)；21版－363項(xiàng)；22版－871項(xiàng)；23版－1188項(xiàng)；24版－含量測(cè)定方法：1386項(xiàng)鑒別：519項(xiàng)雜質(zhì)檢查：206項(xiàng)

如今：在評(píng)價(jià)世界各國(guó)藥典水平時(shí)，HPLC法已成為反映各國(guó)藥典先進(jìn)性的重要指標(biāo)之一。三、高效液相色譜法的分類(lèi)

1.按固定相的聚集狀態(tài)分液－固色譜；液－液色譜

2.按溶質(zhì)在兩相間分離過(guò)程中的物理化學(xué)原理分（1）吸附色譜（AdsorptionChromatography）（2）分配色譜（PartitionChromatography）

（3）離子色譜（IonChromatography）（4）空間排阻色譜（SizeExclusionChromatography

)

（5）親和色譜（AffinityChromatography）

（6）手性色譜（ChiralStationaryChromatography）

3.按流動(dòng)相壓強(qiáng)分（1）高效液相色譜法（HPLC）（2）超高效液相色譜法（UPLC）四、高效液相色譜法的應(yīng)用范圍和局限性1.應(yīng)用范圍

高效液相色譜法適于分析高沸點(diǎn)、受熱不穩(wěn)定易分解、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物；生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物；合成和天然高分子化合物。涉及石油化工產(chǎn)品、食品、藥品、生物化工廠(chǎng)品及環(huán)境污染物。約占全部有機(jī)物的80％。2.方法的局限性

（1）使用多種溶劑為流動(dòng)相，成本高，污染環(huán)境。（2）缺少通用檢測(cè)器

（3）不能完全替代氣相色譜（4）不適于分析受壓分解、變性的具有生物活性的生化樣品分析

綜上，高效液相色譜法與其他分析方法一樣，不是盡善盡美的。作為從事藥物分析工作的人們?cè)谡莆崭咝б合嗌V法的特點(diǎn)、應(yīng)用范圍和局限性的前提下，充分利用高效液相色譜法的特點(diǎn)，就可在解決實(shí)際分析任務(wù)中發(fā)揮重要作用。第二節(jié)高效液相色譜法的基本理論一、高效液相色譜參數(shù)1.定性參數(shù)

tR、t0、2.柱效參數(shù)

σ、w1/2、w

w

=4σ

或W=1.699w1/2

3.相平衡參數(shù)

K=CS/Cmk=ms/mm=CSVS/CmVm=K.

VS/Vm

4.分離參數(shù)R=1.0裸露面積≥95.4％R=1.5裸露面積≥99.7％R≥1.5完全分開(kāi)二、高效液相色譜法的基本理論

色譜分析法的目的是將樣品中各組分彼此分離，達(dá)到可以測(cè)定的目的，然后用合適的方法進(jìn)行定性、定量分析。對(duì)于最難分離的物質(zhì)對(duì)，分離有三種情況：由三種分離情況可得出：

1.兩組分若想分開(kāi)，tR差別應(yīng)足夠大。即兩組分遷移速度

不同－－取決色譜體系熱力學(xué)過(guò)程。

2.兩組分若想分開(kāi)，色譜峰應(yīng)足夠窄。峰寬窄的本質(zhì)是組分在色譜柱內(nèi)的擴(kuò)散及在兩相中達(dá)到分配平衡的速度－－取決色譜體系動(dòng)力學(xué)過(guò)程（一）塔板理論1.前提：四個(gè)基本假設(shè)2.解決的問(wèn)題：（1）較好的描述色譜流出曲線(xiàn)的形狀（2）闡明了溶質(zhì)的分布隨流經(jīng)色譜柱的流動(dòng)相體積的變化規(guī)律及溶質(zhì)濃度極大點(diǎn)的位置（3）定量說(shuō)明色譜柱效以及決定色譜區(qū)域?qū)挾葏?shù)，導(dǎo)出了保留體積的基本關(guān)系式。3.塔板理論是一種具有一定局限性的半經(jīng)驗(yàn)理論，其缺點(diǎn)：（1）不能解釋u不同（同一溶質(zhì)），H（n）不同（2）不能說(shuō)明色譜柱結(jié)構(gòu)參數(shù)、操作條件與塔板數(shù)的關(guān)系（3）忽略了組分在色譜柱內(nèi)的擴(kuò)散和傳質(zhì)，因此不能解釋影響塔板高度的各種因素

綜上：塔板理論對(duì)色譜體系的設(shè)計(jì)和色譜條件的選擇的指導(dǎo)意義有限。（二）速率理論－VanDeemter方程速率理論主要闡述使色譜峰展寬，柱效降低的各種動(dòng)力學(xué)因素

GC速率方程——VanDeemteer方程式

HPLC速率方程——Giddings方程式渦流擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻抗項(xiàng)渦流擴(kuò)散項(xiàng)縱向擴(kuò)散項(xiàng)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗項(xiàng)靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗項(xiàng)固定相傳質(zhì)阻抗項(xiàng)1.渦流擴(kuò)散相（HE）

HE=A=2λdpλ:填充不規(guī)則因子（1～2）

dp：固定相平均粒徑

初始帶寬最終帶寬AuH由上得出：渦流擴(kuò)散相只與固定相填充情況有關(guān)，渦流擴(kuò)散相只與固定相填充情況有關(guān)，與組分、固定相和流動(dòng)相性質(zhì)，流動(dòng)相流速無(wú)關(guān)。2.縱向擴(kuò)散相（HL）

HL=B/u=2γDm/u

γ:柱中填料間的填充因子；

Dm:溶質(zhì)在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)。B線(xiàn)速度uH