蔗糖酶的分離提純及酶促6/10/20231內(nèi)容提示

本實(shí)驗(yàn)含如下內(nèi)容（1、2、3是酶分離提純及比活力測(cè)定部分的內(nèi)容；4、5是酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)部分的內(nèi)容）：1、3，5-二硝基水楊酸比色定糖法（DNS法）工作曲線的制作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測(cè)定（酶活力）；2、Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測(cè)定（蛋白質(zhì)含量）；3、蔗糖酶的分離提純（細(xì)胞破壁、抽提、有機(jī)溶劑分級(jí)、透析和離子交換柱層析—裝柱、上樣、洗柱、洗脫、收集酶活力峰、保存）；4、蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定（用雙倒數(shù)法）；5、用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活力的影響（含實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理的相關(guān)知識(shí)）。6/10/20232

一、目的要求

1.熟悉工作曲線的制作方法及使用注意事項(xiàng)；2.學(xué)習(xí)掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理和方法；3.學(xué)習(xí)掌握Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；4.學(xué)習(xí)酶蛋白分離提純的原理；5.學(xué)習(xí)掌握細(xì)胞破壁、抽提、有機(jī)溶劑分級(jí)、透析和離子交換柱層析技術(shù)；

6.學(xué)習(xí)掌握酶的比活力測(cè)定及其計(jì)算方法；7.學(xué)習(xí)掌握酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中用雙倒數(shù)法測(cè)定Km的方法、選擇確定酶促反應(yīng)最適條件（溫度、pH值、離子濃度等）的方法；8.學(xué)習(xí)《正交試驗(yàn)法》中最簡(jiǎn)單的入門(mén)知識(shí)：用正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案、用極差分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并分析試驗(yàn)結(jié)果。6/10/20233

二、實(shí)驗(yàn)原理前言酶是生物體內(nèi)具有催化功能的蛋白質(zhì)，可據(jù)酶蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)選擇分離提純條件和含量測(cè)定方法。酶分離提純的總目標(biāo)是提高純度（或比活力）及收率；依據(jù)在溶液中的性質(zhì)（分子大小、溶解度、電荷、吸附等）進(jìn)行分離;胞內(nèi)酶的分離提純步驟：選材、破壁、提取、分離、純化、測(cè)活、保存；用測(cè)定酶活力的方法跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度和得率。酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)（反應(yīng)速度及影響因素）:1）底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2）酶濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響3）pH值對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響4）溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響5）激活劑、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響.6/10/202346/10/202356/10/202366/10/202374、Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理：1）凡含有兩個(gè)及兩個(gè)以上肽鍵（—CO—NH—）的化合物（如雙縮脲：H2N—CO—NH—CO—NH2），在堿性溶液中（如Folin-甲試劑）都能與Cu2+作用，形成紫色的復(fù)合物；2）蛋白質(zhì)是由多個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接起來(lái)的，故所有的蛋白質(zhì)均可與Folin-甲試劑反應(yīng)，形成紫色的銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物；3）銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物在pH=10的堿性溶液中可將磷鉬酸-磷鎢酸（Folin-乙試劑）還原成蘭色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物，其顏色的深淺（在一定范圍內(nèi)）與蛋白質(zhì)的含量成正比；在測(cè)定液體蛋白質(zhì)樣品含量的常用方法中（雙縮脲法、Folin-酚法和紫外吸收法），F(xiàn)olin-酚法的靈敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比雙縮脲法高100倍），所以我們選用本方法。6/10/202385、有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀的原理：有機(jī)溶劑分級(jí)是利用不同Pr在不同濃度的有機(jī)溶劑中溶解度的差異分離酶蛋白的一種方法。其原理是：1）有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，增加Pr分子上不同電荷的引力，使蛋白質(zhì)的溶解度下降；2）有機(jī)溶劑與水作用，能破壞Pr的水化膜，使蛋白質(zhì)的溶解度下降。6、離子交換柱層析的原理：是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)。在分離過(guò)程中，以離子交換作用為主導(dǎo)；在眾多的交換劑中，離子交換纖維素的優(yōu)點(diǎn)是：6/10/202391）有開(kāi)放性的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)、較大的表面積，所以對(duì)Pr的吸附容量大；2）纖維素上離子基團(tuán)的數(shù)量不多且排列疏散，對(duì)Pr的吸附不是太牢固，所以用緩和的洗脫條件即可達(dá)到分離的目的，不致引起Pr的變性；3）用其裝好的層析柱在較廣的pH和鹽濃度范圍內(nèi)都不會(huì)發(fā)生體積的改變，所以有利于Pr的層析。本實(shí)驗(yàn)中使用的DEAE-c11是弱堿性的陰離子纖維素，其基本骨架是纖維素、活性基團(tuán)為二乙基氨乙基。該纖維素的吸附量大，分辨率高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。6/10/202310

三、實(shí)驗(yàn)流程

周三晚上6：00開(kāi)始周四下午1：00開(kāi)始1、制備蔗糖酶粗品E1

2、制作DNS比色定糖的工作曲線（當(dāng)天畫(huà)出工作曲線）①自溶3、制作Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的工作曲線（當(dāng)天畫(huà)出工作曲線）②抽提

（過(guò)夜）6/10/2023114、乙醇分級(jí)和透析（制E2）

①離心得E1（無(wú)細(xì)胞抽提液）

取樣、測(cè)定酶E1活力及蛋白質(zhì)濃度②第一次乙醇分級(jí)（32%乙醇飽和度）

③第二次乙醇分級(jí)（47.5%乙醇飽和度）

④透析（過(guò)夜）

6/10/2023125、柱層析的準(zhǔn)備工作①組裝層析裝置②裝柱、柱平衡（過(guò)夜）

6/10/2023136、柱層析（制E3）周五下1：00開(kāi)始①離心（得E2

）

取樣、

測(cè)酶E2活力及蛋白質(zhì)濃度

②上樣

③洗柱（用目測(cè)酶活力的方法檢測(cè)目的酶是否掛上）

④洗脫⑤合并酶活力峰,得E3

⑥保存成品E3測(cè)酶E3活力及蛋白質(zhì)濃度

6/10/202314成品E3

計(jì)算出E3濃度

周六（全天）上午8：00開(kāi)始

(1).蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定

(2).用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活力的影響

6/10/202315四、操作步驟及注意事項(xiàng)

1、

DNS比色定糖法工作曲線的制作①取11支血糖管編號(hào)1—11，按下頁(yè)表中的順序和數(shù)量加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2%）、蒸餾水、3，5-二硝基水楊酸試劑，混勻后同時(shí)放入沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5分鐘（注意：①一定等沸水浴鍋中的水沸騰后再放入試管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴鍋；②用秒表記時(shí)），取出后立即用流動(dòng)的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測(cè)定540nm處的A值。②以葡萄糖(mg)含量為橫坐標(biāo)、A540值為縱坐標(biāo)，畫(huà)出工作曲線。6/10/2023163，5-二硝基水楊酸比色定糖法工作曲線的制作試號(hào)含糖量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液去離子水3，5-二硝基水楊酸試劑A540（mg）（ml）（ml）（ml）1002.03

20.40.21.8330.80.41.6341.20.61.4351.60.81.2362.01.01.0372.41.20.8382.81.40.6393.21.60.43103.61.80.23114.02.003

6/10/202317

2、Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量工作曲線的制作

①取7支試管（干燥）按下表中順序加入各種試劑并進(jìn)行反應(yīng)和測(cè)定

②以1號(hào)管為參比調(diào)零，記錄光密度值A(chǔ)650，以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，A650值為縱坐標(biāo)，畫(huà)出工作曲線。

6/10/202318（二）、目測(cè)酶活力的方法：學(xué)習(xí)《正交試驗(yàn)法》中最簡(jiǎn)單的入門(mén)知識(shí)：用正交表設(shè)計(jì)是根據(jù)物質(zhì)的酸堿度、極性和分子大小的差異，使其分離的技術(shù)。為：-1/Km。學(xué)習(xí)掌握3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理和方法；通常可以通過(guò)以下幾種方法求七、思考題5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)作及三種蔗糖酶樣品（E1、E2、E3）的測(cè)定（酶活力）；21.5ml，搖勻，再加入0.②用秒表記時(shí)），取出后立即用流動(dòng)的冷水冷卻，加蒸餾水定容至25ml，搖勻，測(cè)定540nm處的A值。該表中有3個(gè)同名數(shù)對(duì)，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出現(xiàn)一次。Pr(mg/ml)=×稀釋倍數(shù)63數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計(jì)算**

Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法1.樣品的測(cè)定：取兩支試管（平行）各加入樣品液（稀釋成一定濃度的）1ml，其他操作（反應(yīng)和比色測(cè)定）同工作曲線的制作（前頁(yè)）2.蛋白質(zhì)濃度的計(jì)算：

A650值對(duì)應(yīng)的μg數(shù)(Pr)×10-3

Pr(mg/ml)=×稀釋倍數(shù)

Pr溶液的ml數(shù)6/10/202319**制作工作曲線的注意事項(xiàng)1.分光光度計(jì)的使用：

1）測(cè)樣時(shí),光吸收值A(chǔ)應(yīng)在0.100—0.700之間，并小于標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大值，否則，縮小or加大樣品的稀釋倍數(shù)，重測(cè)！2）其他，見(jiàn)（523室）操作規(guī)程；2.比色杯的使用：1).洗凈（洗凈的標(biāo)準(zhǔn)是：透明、無(wú)痕跡、不掛水珠）后，置小燒杯內(nèi)用蒸餾水浸沒(méi)；2).用蒸餾水orbuffer校正（方法在儀器室講），然后在杯底標(biāo)上記號(hào)（0、1、2、3）；3).向杯中加樣液時(shí)，按濃度從低到高的順序加，注意加樣到比色杯的2/3處；4).如樣液有外溢，先用濾紙條吸干（不許檫）；再用鏡頭紙向一個(gè)方向檫至透明；5).將裝有參比、樣品溶液的比色杯放入比色杯架上時(shí)，要擺放在一條直線上；6/10/2023206).倒出液體后，一定要用洗瓶中的蒸餾水洗凈，然后倒置在濾紙上吸干；7).任何情況下都不許把比色杯放在儀器蓋上；8).自備廢液杯（盛廢液及廢紙塊用）；9).各臺(tái)分光光度計(jì)的比色杯是配套的，不許隨意調(diào)換使用。3.工作曲線的制作（以Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的工作曲線為例）1）反應(yīng)：①取液量準(zhǔn)確：移液管洗凈、標(biāo)號(hào)、潤(rùn)洗，最好同一人取樣；②溫度準(zhǔn)確：（恒溫水浴中放有溫度計(jì)），記時(shí)準(zhǔn)確（用秒表）；③所用的標(biāo)準(zhǔn)液、buffer、反應(yīng)液應(yīng)是同一批配制的；

④加入Folin-乙試劑時(shí)要特別小心！因?yàn)镕olin-乙試劑只有在酸性條件下穩(wěn)定，而反應(yīng)是在堿性溶液中進(jìn)行，所以加入Folin-乙試劑后，一定要迅速搖勻（加一管搖一管）；6/10/2023212）測(cè)量：①由同一個(gè)人讀數(shù)；②制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)量樣品使用同一臺(tái)儀器；3）記錄：①實(shí)驗(yàn)記錄本記錄要清晰（不許用紙片），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要請(qǐng)教師簽字；②記錄儀器使用情況。4）制圖：①標(biāo)明：曲線名稱、縱橫坐標(biāo)的單位、儀器號(hào)、使用時(shí)間；②注意實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的分布、大?。ㄒ罁?jù)誤差）、直線的角度（最好在45度左右）；③不許延長(zhǎng)工作曲線（比耳定律適用于稀溶液中的反應(yīng)）。附：標(biāo)準(zhǔn)液的配制：①濃度必須準(zhǔn)確，要注意烘干、稱量、定容等操作；②分裝or取液時(shí)防止被稀釋！6/10/2023223、蔗糖酶粗品（E1）的制備①自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml燒杯中、少量多次地加入50ml蒸餾水，攪拌均勻，成糊狀后加入1.5g乙酸鈉、25ml乙酸乙酯，攪勻，再于35℃恒溫水浴中攪拌30分鐘，觀察菌體自溶現(xiàn)象；②抽提：補(bǔ)加蒸餾水30ml，攪勻，蓋好，于35℃恒溫過(guò)夜，8000r/min離心10min，棄沉淀及脂層，得E1（無(wú)細(xì)胞提取液）；量體積V1=（）ml（取出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測(cè)酶活力及蛋白質(zhì)濃度）。

4、乙醇分級(jí)和透析（制E2）①測(cè)E1pH、用稀HAC調(diào)pH至4.5（注意少量、慢加、攪勻，防止調(diào)過(guò)）；②第一次乙醇分級(jí)（32%乙醇飽和度）：計(jì)算出使E1的乙醇濃度達(dá)32%時(shí)，所需95%乙醇的體積X1，將E1和乙醇X1，放入冰鹽浴中預(yù)冷，在不斷攪拌下，緩慢滴加乙醇，3000r/min，離心5min，棄沉淀，留上清；

6/10/202323③第二次乙醇分級(jí)（47.5%乙醇飽和度）：同上法加入X2（為達(dá)47.5%乙醇飽和度時(shí)需要補(bǔ)加的95%乙醇的體積），離心3min，棄上清，沉淀立刻用10ml0.005mol/LpH6.0的磷酸buffer溶解，并裝入透析帶（截止分子量一萬(wàn)的），對(duì)上述buffer透析過(guò)夜；次日，3000r/min離心3min，得E2，量體積V2=（）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測(cè)酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其他酶液準(zhǔn)備上樣。5.柱層析（制E3）①裝柱：本實(shí)驗(yàn)使用的層析柱是自加工的，用泡沫海綿為篩板。裝入纖維素前，先把柱內(nèi)裝滿起始緩沖液，用玻璃棒擠壓海綿,趕盡氣泡并把柱子垂直固定；將纖維素用起始緩沖液調(diào)稀、攪允后加入，柱內(nèi)的纖維素應(yīng)非常均勻地分布，防止出現(xiàn)節(jié)面和氣泡，床面要平整，床高距柱頂2－3cm為宜；用起始緩沖液洗柱,控制好流速（防止流干），于4℃平衡過(guò)夜。6/10/202324

②上樣：次日，將柱中的緩沖液逐漸放出，當(dāng)頂部液面達(dá)到近于柱床表面時(shí)，開(kāi)始用細(xì)長(zhǎng)的玻管沿柱壁繞環(huán)加入酶樣E2，待樣液達(dá)2cm后再在柱中間小心加樣，注意控制流速，使流出液的流出速度為1ml/min左右。

③洗柱：樣品全部進(jìn)入床面后，用5倍柱體積的起始緩沖液流過(guò)層析柱，洗出未吸附的物質(zhì)，此時(shí)應(yīng)目測(cè)酶活力，檢查流出液中是否有酶活力存在（即目的酶是否掛在纖維素上）。

④洗脫：因梯度洗脫裝置不齊，本實(shí)驗(yàn)用階段洗脫進(jìn)行。用含0.15mol/LNaCl的0.005mol/LpH6.0的磷酸緩沖液100ml，控制流速為1ml/min,用小試管收集，3ml/每管。

⑤收集酶活力峰：每隔一管目測(cè)酶活力，確定酶活力峰的位置，合并酶活力峰,得進(jìn)一步提純的E3，量出E3的體積V3=（）ml（留出2ml置于冷處或冰鹽浴中保存，待測(cè)酶活力及蛋白質(zhì)濃度），其它酶液封好、記名，于4℃保存，留反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)使用。

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6、蔗糖酶活力及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

（一）、蔗糖酶活力的測(cè)定：1.蔗糖酶活力的規(guī)定：在本實(shí)驗(yàn)條件下，每3分鐘釋放1毫克還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位。2．操作：取兩支試管分別加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸緩沖液適當(dāng)稀釋

過(guò)的酶液2ml，一支中加入0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，使酶失活（做對(duì)照），另一支做測(cè)定管；把兩支試管和5%的蔗糖溶液放入35℃水浴中預(yù)熱恒溫；分別取2ml5%的蔗糖加入上述兩試管中，并準(zhǔn)確計(jì)算時(shí)間，3分鐘后于測(cè)定管中加入0.5ml1mol/L的NaOH，搖勻，終止反應(yīng)3.從反應(yīng)混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml3,5二硝基水揚(yáng)酸試劑和1.5ml水，搖勻。于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min，立即用冷水冷卻，加水稀釋至25ml，搖勻，于540nm處測(cè)光密度。4.在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到所測(cè)定光密度值對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量，按下面公式計(jì)算酶活力：蔗糖酶活力單位=葡萄糖毫克數(shù)×9×酶的稀釋倍數(shù)6/10/202326（二）、目測(cè)酶活力的方法：1.洗柱時(shí)用的目測(cè)酶活力方法：取兩支試管，各加入1ml5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始緩沖液，另一支中加1ml洗柱流出液，同時(shí)于35℃恒溫水浴中進(jìn)行水解反應(yīng)3min，然后各加DNS試劑1ml，于沸水浴中反應(yīng)5min，比較兩支試管顏色的深淺；2.收集酶活力峰時(shí)用的目測(cè)酶活力方法：于收集管（每隔一管）中取0.1mlE液+1ml5%蔗糖液，于35℃水解反應(yīng)3min后，加0.2ml1mol/LNaOH終止反應(yīng)，然后加DNS試劑1ml，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min，比較各管顏色的深淺，再加密實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，重復(fù)測(cè)定，確定酶活力峰的位置。（三）、三種蔗糖酶（E1、、E2、E3）蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定：用Folin-酚法測(cè)定。

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五、結(jié)果及數(shù)據(jù)處理

1.洗脫曲線

蛋白酶質(zhì)活含力量管號(hào)2.原始數(shù)據(jù)

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3.數(shù)據(jù)處理

有關(guān)計(jì)算

1）[E]=葡萄糖mg數(shù)×（4.5/0.5）×E的的稀釋倍數(shù)/2ml=（）u/ml2）總活力：[E]×V3）[Pr]：查標(biāo)準(zhǔn)曲線4）總Pr量：[Pr]×V5）比活力：[E]/[Pr]or總活力/總Pr量6）階段收率：E2活力/E1活力、E3活力/E2活力7）總收率：E3總活力/E1總活力8）提純倍數(shù)：比活力n/比活力n-1n=1，2，3

將計(jì)算出的數(shù)據(jù)添入下表中：6/10/2023294.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表蔗糖酶酶樣品E１E２E３酶濃度總活力蛋白濃度總蛋白量比活力提純倍數(shù)階段收率總收率（ml）（u/ml）（u）（mg/ml）（mg）（u/mg）（%）（%）樣品體積6/10/202330

六、主要參考資料

1、李建武主編.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法.北京大學(xué)出版社.1994該書(shū)中的：p36-46（離子交換層析法）2、沈同王鏡巖主編.生物化學(xué)第二版上冊(cè)高等教育出版社.1993該書(shū)中的：p209、210、215、216、220中有關(guān)論述3、張樹(shù)政主編.酶制劑工業(yè)上冊(cè).科學(xué)出版社.19986/10/202331

七、思考題

1）指出有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法的原理及操作中的注意事項(xiàng)。2）

說(shuō)明離子交換柱層析的原理及裝好層析柱的具體要求。3）

比較線性梯度洗脫與階段洗脫的區(qū)別。4）分別指出判斷酶損失程度和酶提純方法優(yōu)劣的標(biāo)志。6/10/202332其它1）這個(gè)實(shí)驗(yàn)較大，涉及到的理論知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)都較多，用的時(shí)間也很長(zhǎng)，要求同學(xué)們一定做好預(yù)習(xí)，寫(xiě)好預(yù)習(xí)報(bào)告（方式不限，但一定要寫(xiě)在本子上，并留出記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的位置），否則將嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度！2）你們年級(jí)的理論課還沒(méi)講到酶學(xué)部分，預(yù)習(xí)時(shí)可以看實(shí)驗(yàn)課教材（我在編寫(xiě)時(shí)已經(jīng)進(jìn)行了整理和補(bǔ)充）,但教材中有印刷錯(cuò)誤,應(yīng)以該課件為準(zhǔn).3）本實(shí)驗(yàn)從一開(kāi)始，就要縱觀全局，在各個(gè)環(huán)節(jié)都要注意防止酶失活；只要時(shí)間允許，一定要用測(cè)定酶活力的方法跟蹤酶的去向；4）實(shí)驗(yàn)制品E3要保留！酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)用。6/10/202333蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定

一、目的要求：了解底物濃度與酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系，學(xué)習(xí)蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：米氏常數(shù)Km等于酶反應(yīng)速度達(dá)最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度，單位是mol/L。對(duì)于某一種特定的酶，在特定的反應(yīng)條件下，對(duì)應(yīng)任何一種底物（如果它具有多個(gè)底物），它的米氏常數(shù)Km是一個(gè)定值。在一個(gè)反應(yīng)中，底物的濃度（S）是可以控制的，反應(yīng)的速度（V）可以測(cè)出，這樣就可根據(jù)底物的濃度和反應(yīng)的速度求出該酶在本實(shí)驗(yàn)條件下的米氏常數(shù)。通常可以通過(guò)以下幾種方法求出Km值：1）直接將數(shù)據(jù)代入米氏方程。2）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法（本實(shí)驗(yàn)采用該法），橫軸的截距為：-1/Km。3）Hanes-Woolf作圖法，橫軸的截距為：-Km。4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作圖法，斜率為：-Km。5）Eadie-Scatchard作圖法，斜率為-1/Km。6/10/202334三、操作方法：1.取試管8支，按0、1--7編號(hào)，0為空白。2.按表1將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35℃水浴中保溫（使溫度平衡，以下同）10min。3.取約20ml酶液，放入同一水浴中保溫約10min。4.于各管中依次按同樣時(shí)間間隔加入已保溫過(guò)的酶液2ml，記時(shí)，立即搖勻。在35℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min。5.按同樣次序和時(shí)間間隔，加入0.5ml的1mol/LNaOH，搖勻，終止反應(yīng)。6.吸取反應(yīng)混合物0.5ml，加入盛有1.5mlDNS試劑和1.5ml去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋定容至25ml，搖勻后，測(cè)定A540值。6/10/202335表1Km值的測(cè)定

6/10/202336四數(shù)據(jù)處理：以A值作為相對(duì)反應(yīng)速度，以1/S為橫坐標(biāo)，1/A為縱坐標(biāo)作圖，由圖求出Km值。五、思考題：1.

說(shuō)明米氏常數(shù)的物理意義及單位？2.

用雙倒數(shù)法測(cè)定Km值時(shí)，應(yīng)注意的主要問(wèn)題是什么？

6/10/202337用正交法測(cè)定幾種因素對(duì)蔗糖酶活力的影響一、目的要求1.初步掌握正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的使用；2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值。二、實(shí)驗(yàn)原理1.酶的催化作用是在一定條件下進(jìn)行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應(yīng)的速度。通常是在其他因素恒定的條件下，通過(guò)對(duì)某因素在一系列變化條件下的酶活性測(cè)定，求得該因素對(duì)酶活力的影響，這是單因素的簡(jiǎn)單比較法。本實(shí)驗(yàn)使用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法測(cè)定溫度、pH值、和離子濃度三種因素對(duì)蔗糖酶活性的影響，這是多因素（≥3）的實(shí)驗(yàn)方法。6/10/202338

正交法是通過(guò)正交表安排多因素實(shí)驗(yàn)，利用統(tǒng)計(jì)數(shù)學(xué)原理進(jìn)行數(shù)據(jù)分析的一種科學(xué)方法，它符合“以盡量少的試驗(yàn)，獲得足夠的、有效的信息”的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則。2.本實(shí)驗(yàn)以自制的蔗糖酶（E3）為測(cè)定對(duì)象。蔗糖酶是一種水解酶，可使蔗糖水解為D-果糖和D-葡萄糖。

酶活性的測(cè)定，是利用DNS試劑與D-葡萄糖共熱后生成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，葡萄糖的量和反應(yīng)液的顏色呈比例關(guān)系，利用比色法可測(cè)得酶促反應(yīng)后生成的還原糖量。6/10/202339三、操作方法

1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：1）確定指標(biāo)：即實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)是酶活力。這里，用A540值表示，能落在葡萄糖工作曲線范圍內(nèi)的A540值越高，指標(biāo)越好。2）制定因素水平表：考察三個(gè)因素（溫度、pH值和離子濃度），每個(gè)因素取三個(gè)水平。水平是因素變化的范圍（通常是根據(jù)專業(yè)知識(shí)確定。如無(wú)資料可借鑒，應(yīng)先加寬范圍再逐步縮小）內(nèi)要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的具體條件，如表1。

6/10/202340

表1因素水平表

6/10/2023413）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（36×6）和L27（38×9）。本實(shí)驗(yàn)不考察各因素間的交互作用，也沒(méi)設(shè)計(jì)混合水平，只有水平數(shù)均為3的的三個(gè)因素，故選用L9（34）表，見(jiàn)表2。按一般的實(shí)驗(yàn)方法：①簡(jiǎn)單比較法（最常用），因?qū)嶒?yàn)點(diǎn)分配不均衡，易把好條件漏掉，又因數(shù)據(jù)無(wú)規(guī)律而對(duì)結(jié)果無(wú)法進(jìn)行分析和判斷。②全面實(shí)驗(yàn)法：（即對(duì)三個(gè)因素三個(gè)水平的各種搭配都考察）要進(jìn)行33=27次實(shí)驗(yàn)。而用正交表L9（34），只做九次實(shí)驗(yàn)，就可以找到好的實(shí)驗(yàn)條件。6/10/202342而且，還可以進(jìn)行如下分析：A.判斷各因素的水平范圍是否選偏；B.判斷各因素顯著性大小的順序；C.判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的置信度。由表2可見(jiàn)，正交表L9（34）有任何正交表都具有的如下特點(diǎn)：A.任何一列各水平出現(xiàn)的次數(shù)相等，該表均為3次。6/10/202343

表2正交表L9（34）

6/10/202344B.任何兩列橫行組成的數(shù)字對(duì)出現(xiàn)的次數(shù)都相等。該表有9個(gè)數(shù)字對(duì)，即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3）都出現(xiàn)一次。C.任何兩列同名數(shù)對(duì)出現(xiàn)的次數(shù)都相等。該表中有3個(gè)同名數(shù)對(duì)，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出現(xiàn)一次。以上特點(diǎn)，保證了用正交表安排的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃是均衡搭配的，因此可以進(jìn)行綜合比較和方差分析。4）安排實(shí)驗(yàn)：將本實(shí)驗(yàn)的三個(gè)因素分別放在L9（34）表的第1、2、3列中，再將各列的水平數(shù)用該因素相應(yīng)的水平寫(xiě)出來(lái)，即得到實(shí)驗(yàn)安排表，見(jiàn)表4的上半部分。6/10/2023452.具體操作步驟：

1）將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于9支試管中按表3進(jìn)一步稀釋至一定濃度。表3三種不同pHbuffer的稀釋表6/10/2023462）另取18支試管，編號(hào)1—9及1`--9`（平行組），按表4中2、3列的要求，分別加入上述不同pH不同濃度的緩沖液2ml及蔗糖酶液（濃度15U/ml左右）1ml，混勻。3）按表4中第一列的要求，將1—9及1`--9`試管分別放入相應(yīng)溫度的恒溫水浴中保溫10min。4）另取足量的0.2mol/L蔗糖液三份，分別置于20℃、35℃、50℃水浴中保溫5min。5）向1—9及1`--9`試管中，依次間隔1min（或2min）加入相同溫度下保溫過(guò)的0.2mol/L蔗糖液1ml，立即記時(shí)，搖勻，放回原來(lái)溫度的水浴中，準(zhǔn)確反應(yīng)3min。6）按上述次序和時(shí)間間隔，加入1mol/LNaOH液0.5ml，搖勻。7）空白管