第十八章電泳第一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、高效毛細(xì)管電泳技術(shù)基本原理

最基本的高效毛細(xì)管電泳儀器如圖1所示：圖1毛細(xì)管電泳基本儀器結(jié)構(gòu)示意圖HV.高壓電源(0~30kV)；C.毛細(xì)管；E.電極槽；Pt.鉑電極；D.在柱檢測器；S.樣品；DA.數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)第二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五樣品在毛細(xì)管中的分離過程如圖2所示：分離過程：電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；

中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反。ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。

圖2毛細(xì)管電泳分離示意圖第三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)

由于毛細(xì)管具有良好的散熱效能，允許在窄內(nèi)徑毛細(xì)管兩端加上高達(dá)30kV的高電壓，分離毛細(xì)管的縱向電場強(qiáng)度可達(dá)400V/cm以上，可以在很短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到很高的分離效率，具有以下特點(diǎn)：

（1）分離速度快（高壓、高電場強(qiáng)度）在3.1min內(nèi)分離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)分離了24種陽離子（2）分離效率高（N>105~106）（3）運(yùn)行成本低（4）樣品與試劑消耗量少（1~50nL）（5）可供選擇的分離模式多，應(yīng)用范圍廣（6）分離一般在水溶液介質(zhì)中進(jìn)行（7）方法簡單，儀器自動(dòng)化程度高（8）環(huán)境污染小第四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五表1

高效毛細(xì)管電泳與高效液相色譜性能比較

第五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、毛細(xì)管電泳簡單歷史

（1）1967年Hjerten首先報(bào)道了開管毛細(xì)管電泳，后來Virtanen和Mikkers先后分別在約200

m內(nèi)徑的玻璃或Teflon毛細(xì)管中進(jìn)行電泳，這些是毛細(xì)管電泳的最初期工作。（2）1981年，Jorgenson和Lukacs使用75m內(nèi)徑100cm的玻璃毛細(xì)管在30kV的高電壓下進(jìn)行電泳，獲得了數(shù)十萬理論塔板數(shù)的高分離效率，使毛細(xì)管電泳技術(shù)有了突破性進(jìn)展。第六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

（3）1984年，Terabe發(fā)展了毛細(xì)管電泳的新分支-毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(MEKC)（4）1987年,Hjerten提出了毛細(xì)管等電聚焦(CIEF)。同年，Cohen和Karger發(fā)表了毛細(xì)管凝膠(CGE)的研究工作。到此為止，毛細(xì)管電泳所有傳統(tǒng)分離模式全部誕生，標(biāo)志著毛細(xì)管電泳技術(shù)的發(fā)展成熟。第七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

圖3常用幾種型號(hào)的高效毛細(xì)管電泳儀第八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五二、高效毛細(xì)管電泳儀器流程和主要部件

電壓：0～30kV；分離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測器；（可檢測到：10-19～10-21mol/L）圖4高效毛細(xì)管電泳流程圖

圖5高效毛細(xì)管電泳基本裝置第九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五1.高壓電源（1）0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；2.毛細(xì)管柱

（1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差；（2）規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m3.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；第十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

類型檢測限/mol特點(diǎn)紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導(dǎo)10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置表2各種類型檢測器性能列表5、高效毛細(xì)管電泳進(jìn)樣方式進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-2%；納升級、非常小(1)流體力學(xué)進(jìn)樣方式a、進(jìn)樣端加壓b、出口端抽真空c、虹吸進(jìn)樣第十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五（2）電動(dòng)進(jìn)樣方式毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；特點(diǎn)：進(jìn)樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度小的進(jìn)樣量大；離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進(jìn)不去；特別適合黏度大的試樣（3）擴(kuò)散進(jìn)樣試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱端口處第十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五三、高效毛細(xì)管電泳理論（theoryofHPCE）（一）高效毛細(xì)管電泳(HPCE)基本原理

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動(dòng)，不同離子具有不同的遷移速度，當(dāng)帶電離子以速度ν在電場中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。淌度μ：單位電場強(qiáng)度下的平均電泳速度

第十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五（二）電滲現(xiàn)象與電滲流(electroosmosisandelectroosmoticflow)1、電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。圖6毛細(xì)管電泳中的電滲現(xiàn)象

當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。

電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。第十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流

石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH>3時(shí)，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度ν電滲流。

圖7毛細(xì)管電泳中電滲現(xiàn)象和電滲流第十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、HPCE中電滲流的大小與方向（1）電滲流大小計(jì)算公式電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強(qiáng)度E。即ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢，即μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細(xì)管壁的Zeta電勢（擴(kuò)散層電勢）

。ν電滲流=ε0εξE實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細(xì)管有效長度；teo—電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。第十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五

（2）HPCE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極改變電滲流方向的方法：

（1）毛細(xì)管改性表面鍵合陽離子基團(tuán)；（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽極。第十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、HPCE中電滲流的流形

電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)（譜帶展寬很?。灰合嗌V中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。圖8毛細(xì)管電泳電滲流流形和液相色譜流形的比較第十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五5、HPCE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。第十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五（三）HPCE中影響電滲流的因素1、電場強(qiáng)度的影響電滲流速度和電場強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。2、毛細(xì)管材料的影響不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；

圖9不同材料毛細(xì)管pH對電滲流的影響第二十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響（1）溶液pH的影響對于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。（2）陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。第二十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五圖10離子強(qiáng)度對電滲流的影響第二十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時(shí)，產(chǎn)生的熱量；

HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強(qiáng)度成正比。溫度每變化1oC，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；第二十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五5、添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；（3）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。第二十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五第二十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五（四）淌度（mobility）淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。1、絕對淌度(absolutemobility)μab無限稀釋溶液中帶電離子在單位電場強(qiáng)度下的平均遷移速度，簡稱淌度。可在手冊中查閱。2、有效淌度(effectivemobility)μef實(shí)際溶液中的淌度(實(shí)驗(yàn)中測定的)。μef=∑aiμiai—溶質(zhì)i的解離度；μi—溶質(zhì)i在解離狀態(tài)下的絕對淌度3、表觀淌度μap離子在實(shí)際分離過程中的遷移速度（表觀遷移速度）：νap=μapE第二十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五（五）HPCE中的參數(shù)與關(guān)系式1、遷移時(shí)間（保留時(shí)間）HPCE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長度2、分離效率（塔板數(shù)）

在HPCE中，僅存在縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt

擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。第二十七頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長度與總長度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算。（六）影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬

1、縱向擴(kuò)散的影響在HPCE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：σ2=2Dt由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。第二十八頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、進(jìn)樣的影響

當(dāng)進(jìn)樣塞長度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率明顯下降；理想情況下，進(jìn)樣塞長度：Winj=(24Dt)1/2實(shí)際操作時(shí)進(jìn)樣塞長度小于或等于毛細(xì)管總長度的1%～2%。3、焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計(jì)算：m—電解質(zhì)溶液的摩爾電導(dǎo)；I—工作電流：cb—電解質(zhì)濃度；散熱過程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。改善方法：（1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑；（2）控制散熱；第二十九頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五4、溶質(zhì)與管壁間的相互作用

存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬；蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，吸附問題特別嚴(yán)重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機(jī)會(huì)。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強(qiáng)電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負(fù)電，帶正電一端與管壁負(fù)電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時(shí)，抑制對蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對電滲流影響不大。第三十頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五5、其他影響因素（1）電分散作用對譜帶展寬的影響

當(dāng)溶質(zhì)區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導(dǎo)不同時(shí)，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質(zhì)溶液。（2）“層流”現(xiàn)象對譜帶展寬的影響一般情況下，HPCE中不存在層流，但當(dāng)毛細(xì)管兩端存在壓力差時(shí)，出現(xiàn)拋物線形的層流；產(chǎn)生的原因：毛細(xì)管兩端液面高度不同。實(shí)際操作時(shí)，保持毛細(xì)管兩端緩沖溶液平面高度相同。第三十一頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五四、高效毛細(xì)管電泳分離模式1、毛細(xì)管電泳分離模式：區(qū)帶毛細(xì)管電泳(capillaryzoneelectrophoresis,CZE)毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜(micellarelectrokineticcapillarychromatography,MEKC)毛細(xì)管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis,CGE)毛細(xì)管等電聚焦(capillaryisoelectricfocusing,CIEF)毛細(xì)管等速電泳(capillaryisotachophoresis,CITP)毛細(xì)管陣列電泳(capillaryarrayelectrophoresis,CAE)根據(jù)試樣性質(zhì)不同，采用不同的分離類型；每種機(jī)理的選擇性不同第三十二頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五五、高效毛細(xì)管電泳應(yīng)用（一）應(yīng)用1、離子分析（analysisofion）

陽離子分析遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子；陽極進(jìn)樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度；

圖13陽離子分離毛細(xì)管電泳圖第三十三頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五陰離子分析

陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時(shí)間長、效率低；質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測；加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進(jìn)樣，陽極檢測；離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析

圖14陰離子毛細(xì)管分離圖第三十四頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五2、藥物分析

檢測體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11min內(nèi)分離17種藥物圖1517種藥物毛細(xì)管電泳分離圖第三十五頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五采用MEKC（毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜）模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLC法

圖16違禁藥物毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜分離圖第三十六頁，共四十一頁，編輯于2023年，星期五3、