外周血PSA、PSAmRNA聯(lián)合檢測在前列腺癌診斷中的臨床應用【摘要】目的探討利用外周血PSA、PSAmRNA聯(lián)合檢測診斷前列腺癌的臨床應用及意義。方法運用酶聯(lián)免疫分析和巢式RTPCR檢測22例PCa、10例良性前列腺增生患者，5例健康男性和5例健康女性外周血中PSA、PSAmRNA的情況。結(jié)果PCa患者血清PSA的水平與臨床分期、Gleason評分有關，而與年齡無關；外周血PSA、PSAmRNA與臨床分期、內(nèi)分泌治療有關，而與年齡、Gleason評分無關；22例PCa標本中PSAmRNA陽性表達15例，陽性率68%，10例BPH和10例陰性對照標本無表達。結(jié)論利用外周血PSA、PSAmRNA聯(lián)合檢測是一種早期發(fā)現(xiàn)PCa微轉(zhuǎn)移，判斷其臨床變化過程、分期、預計復發(fā)和評價療效的方法。

【關鍵詞】前列腺特異抗原；前列腺癌；前列腺增生；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應

臨床上大約有50%的前列腺癌(PCa)病人在確診時就已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移,病變已屬晚期，預后不良〔1～3〕。國外報道血清游離PSA與外周血PSAmRNA聯(lián)合檢測PCa在鑒別良、惡疾病上有一定優(yōu)越性〔4，5〕。國內(nèi)這方面報道較少。應用RTPCR技術檢測外周血中存在的少量癌細胞，可以發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移，對腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移、預后及臨床治療具有指導意義〔6，7〕。本研究采用酶聯(lián)免疫技術和巢式RTPCR技術聯(lián)合檢測外周血PSA和PSAmRNA，以提高PCa微轉(zhuǎn)移的診斷效率、監(jiān)測復發(fā)、預測腫瘤分期及預后。

1材料與方法

11病例資料

PCa組：選擇2005～2006年佳木斯大學附屬第一醫(yī)院、佳木斯市中心醫(yī)院門診和住院病人。22例均為初診PCa患者，均經(jīng)前列腺穿刺病理診斷，年齡64～82歲，平均72歲。22例PCa患者中有15例接受了內(nèi)分泌治療，7例未接受。BPH組：10例均為行前列腺經(jīng)尿道電切術后病理證實患者，年齡34～81歲，平均65歲。陰性對照組：5例男性健康志愿者和5例女性健康志愿者，血液學指標均正常，年齡25～45歲，平均38歲。

12儀器及材料

Ficoll淋巴細胞分離液購自中國醫(yī)學科學院天津血液病研究所，總RNA提取RNAiso試劑盒、兩步法RTPCR試劑盒購自大連生物工程有限公司，引物由上海生物工程服務技術有限公司合成，PSA定量試劑盒購自美國博檢生物試劑有限公司。BiometraTgPCR儀：華粵企業(yè)集團有限公司；DU800核酸蛋白分析儀：Beckman公司；免疫分析儀器：DNM9602G型酶標分析儀。

13引物序列

PCR引物：外引物：PSA494：5’TACCCACTGCATCAGGAACA3’；PSA960：5’CCTTGAAGCACACCATTACA3’。內(nèi)引物：PSA559：5’ACACAGGCCAGGTATTTCAG3’；PSA894：5’GTCCAGCGTCCAGCACACAG3’。βactin上游：5’CGGGAAATCGTGCGTGACAT3’；下游：5’GAACTTTGGGGGATGCTCGC3’。擴增目的片段長度為712bp。

14血清的提取

抽取空腹靜脈血5ml，立即2000r/min離心10min，分離血清置-20℃保存，1w內(nèi)完成實驗。

15外周血單個核細胞的提取

抽取5ml靜脈血肝素抗凝，用Ficoll淋巴細胞分離液分離白細胞置-80℃冰箱保存，提取過程按其說明書操作。

16總RNA的抽提及質(zhì)量鑒定

用Trizal試劑提取總RNA，提取過程按其說明書操作。提取產(chǎn)物用12%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。紫外分光光度計下測OD260、OD280，測定RNA純度和濃度。取OD260/OD280值在18～20范圍內(nèi)的標本進行逆轉(zhuǎn)錄。所有實驗中的塑料制品及實驗用具均經(jīng)01%DEPC水處理后高壓滅菌。

17RTPCR

取1μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應；取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl和PSA上下游外、內(nèi)引物各1μl，使用20μl反應體系進行2次PCR，同時擴增PSA、βactin和陰性對照cDNA。具體循環(huán)參數(shù)為：94℃4min，94℃45s，55℃30s，72℃45s；25個循環(huán)之后，72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用EB染色，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

18血清PSA的檢測

PSA定量檢測由專人嚴格按說明書進行操作。

19統(tǒng)計學處理

應用SPSS100軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用t檢驗、χ2檢驗。

2結(jié)果

21PCa組、BPH組、陰性對照組血清PSA檢測結(jié)果見表1。表1PCa組、BPH組、陰性對照組血清PSA的檢測結(jié)果

22PCa組血清PSA檢測結(jié)果與臨床參數(shù)的關系

見表2。表2PCa組血清PSA與臨床參數(shù)的關系(略)

PCa組血清PSA的水平在3個年齡分組中總體比較無顯著性差異，在3個臨床分期中總體比較有顯著性差異，在3種Gleason評分中總體比較有顯著性差異。

23PCa組、BPH組、陰性對照組外周血PSAmRNA表達情況

PCa病人外周血標本經(jīng)PSA巢式PCR外、內(nèi)引物兩次擴增后，產(chǎn)物在同一瓊脂糖上得到PSA的RTPCR特異性條帶。PSA經(jīng)巢式PCR擴增最終可得到特異性條帶。PCa組、BPH組、陰性對照組外周血PSAmRNA表達情況見表3。表3PCa組、BPH組、陰性對照組外周血PSAmRNA表達情況

PCa組PSAmRNA陽性表達明顯高于BPH組，差異有顯著性意義。

24PCa組外周血PSAmRNA表達情況與臨床參數(shù)的關系

見表4。表4PCa組外周血PSAmRNA表達情況與臨床參數(shù)的關系

PSAmRNA表達情況在3個年齡分組中總體比較差異無顯著性，在3種Gleason評分中總體比較無顯著性差異，在3種臨床分期中總體比較差異有顯著性，在是否內(nèi)分泌治療分組中總體比較差異有顯著性。

1～7泳道為第1次PCR陽性結(jié)果，長度為466bp；8～14泳道為第2次PCR陽性結(jié)果，長度為335bp；15泳道為DL2000Maker

3討論

目前對PCa診斷的方法主要有直腸指檢、影像學、針吸細胞病理學、前列腺穿刺活檢以及PCa腫瘤標志物PSA檢測等。而這些方法很難診斷PCa的早期轉(zhuǎn)移,因此人們努力尋找能早期發(fā)現(xiàn)腫瘤,監(jiān)測微轉(zhuǎn)移的方法。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的一個重要標志，是腫瘤術后復發(fā)、放療和化療失敗的主要原因，也是腫瘤患者治愈率得不到提高的主要影響因素。許多腫瘤在淋巴結(jié)、外周血、骨髓中微轉(zhuǎn)移灶的檢出對腫瘤的診斷、分期、復發(fā)和預后的判斷、手術、綜合治療的選擇具有明顯的指導意義〔8〕。

PSA是一種獨特的酶〔9〕，是由前列腺上皮細胞分泌的糖蛋白〔10〕，是前列腺上皮細胞的特異標志物，而不是PCa的特異標志物。PSAmRNA在正常人外周血中不表達,只在前列腺組織特異性表達；當表達PSAmRNA的癌細胞脫落進入血液循環(huán)后,外周血中才能檢測出PSAmRNA,只有PCa才能出現(xiàn)這種情況〔11〕。血清PSA的敏感性為46%，特異性為91%；與外周血PSAmRNA聯(lián)合檢測，敏感性為81%，特異性為95%。而對健康男性、BPH患者和女性的檢測結(jié)果均為陰性，PCa和BPH患者的血清PSA水平有部分的重疊〔5，12〕，這將使部分PCa患者漏診或使部分BPH患者遭受不必要的穿刺活檢。

在本實驗中PCa組血清PSA水平明顯高于BPH組，但是B期PSA的水平與BPH比較無顯著性差異。PSA巢式PCR的敏感性高，能夠檢出1/106個目的細胞，所以當表達PSAmRNA的癌細胞脫落進入血液循環(huán)時，就可以被檢測到。22例PCa標本中PSAmRNA陽性表達15例，陽性率68%，低于國內(nèi)相關文獻報道的結(jié)果〔13〕。可能與檢測例數(shù)較少和循環(huán)血中的癌細胞受到體內(nèi)多種免疫調(diào)控機制、癌細胞水平和入血時間等多種因素的

影響有關〔13〕。10例BPH和10例陰性對照標本無表達。所以將RTPCR方法檢測血中PSAmRNA與血清PSA檢測聯(lián)合起來要比單純檢測血清中的PSA，更有助于鑒別PCa和BPH。由于PCa明確的病理分期關系著患者的治療方案和治療的預后，本研究深入探討了PSA和PSAmRNA與年齡、臨床分期、病理分級之間的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)血清PSA的水平與臨床分期、Gleason評分有關，而與年齡無關；臨床分期越晚、病理分化越差者PSA的水平越高。還發(fā)現(xiàn)PSAmRNA與臨床分期、內(nèi)分泌治療有關，而與年齡、病理分級無關。7例B期PCa患者中有4例PSAmRNA表達陽性，陽性率57%，較早的發(fā)現(xiàn)了PCa細胞的微轉(zhuǎn)移。15例已有轉(zhuǎn)移的患者中有11例表達陽性，陽性率73%，說明RTPCR方法能夠較好的監(jiān)測微轉(zhuǎn)移，預測預后。22例PCa患者中有15例接受了內(nèi)分泌治療，7例未接受。在接受內(nèi)分泌治療組中PSAmRNA表達陽性為33%，而未接受內(nèi)分泌治療組中PSAmRNA表達陽性為57%，差別有顯著意義，證明內(nèi)分泌治療有明顯的作用，如能防止內(nèi)分泌耐受細胞的生成，將有效的延長患者的生命并提高生活質(zhì)量。利用外周血PSA、PSAmRNA聯(lián)合檢測可以提高Pca的檢出率，是一種早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移、判斷臨床變化過程、分期、預后和評價療效的無創(chuàng)方法。

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