實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)限的統(tǒng)計(jì)推斷【摘要】檢測(cè)限是檢測(cè)方法的重要性能指標(biāo)，用Poisson分布的概率函數(shù)分式計(jì)算一次抽樣檢測(cè)出現(xiàn)的結(jié)果推論總體出現(xiàn)該結(jié)果的概率。以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(FQPCR)檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA結(jié)果為例，計(jì)算可知，一次抽樣反應(yīng)管的檢測(cè)結(jié)果≥4時(shí)，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性()。因而檢測(cè)血清中病原體時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)管中的檢測(cè)限是4拷貝/ul計(jì)算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結(jié)果為0的概率可達(dá)，結(jié)果在0拷貝/ul～4拷貝/ul的概率為，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0。結(jié)果在905拷貝/ml～1095拷貝/ml的概率為；而100000拷貝/L表示一次抽樣結(jié)果在997000拷貝/L～1003000拷貝/L的概率為。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至L。

【關(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)熒光定量PCR；檢測(cè)限；統(tǒng)計(jì)推斷

StatisticalConclusionofLimitofQuqntitationinRealtimeFluorescenceQuantitativePCR

Abstract:LimitofquantiationisaimportantperformanceindexofassayofsampledrawingarecalculatedthroughpossiblityfunctionequationofPoissondistribution,thenthepossibilityofresultsemergedinpopulationisexample,inRealtimeFluorescencequantitaivePCRtoassayHBVDNA,onlywhensampledrawingresults≥4,significanceofdifference()couldbededucedbetweenpopulationandlimitofquantitationis4copies/uldenoting0inonesampledrawingis0,andPossibilityofresultsbetween905copies/mlto1095copies/mlisof100000copies/Ldenotingresultsbetween997000copies/Lto1003000copies/LinonesampledrawingisdrawingunitulcouldnotbereplacebymlorL.

Keywords：RealtimeFluorescencequantitativePCR；Limitofquantitation;Statisticalconclusion

檢測(cè)限是檢測(cè)方法的重要性能指標(biāo)，只有在檢測(cè)報(bào)告中明確表達(dá)了檢測(cè)方法的檢測(cè)限，該檢測(cè)報(bào)告在各實(shí)驗(yàn)間及同一項(xiàng)目的各種檢測(cè)方法間才可進(jìn)行比較。能檢測(cè)到的最低分析物濃度為檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)限。當(dāng)前，檢測(cè)限術(shù)語(yǔ)混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllyticalsensitivity)、定量限度(limitofquantitqtion)等［1］。每個(gè)詞語(yǔ)的實(shí)際含義中包含有各自的實(shí)驗(yàn)方式、數(shù)據(jù)處理方式及由數(shù)據(jù)作出的推論等。我們采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以期得到一致的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,FQPCR)檢測(cè)限，現(xiàn)介紹如下。

1文獻(xiàn)中FQPCR檢測(cè)限的描述

檢測(cè)乙型肝炎病毒DNA的文獻(xiàn)中檢測(cè)限使用了“最低檢出量”［2，3］、靈敏度［5～7］等術(shù)語(yǔ)，它等于已知的高拷貝HBVDNA血清10倍系列稀釋后能檢測(cè)到擴(kuò)增曲線的最大稀釋倍數(shù)管濃度。表述有：陰性HBVDNA≤106拷貝/升［4］；熒光定量PCR法檢測(cè)靈敏度102拷貝/ml［5］、104拷貝/ml［6］、×102拷貝/ml［7］；HCⅡ法檢測(cè)靈敏度×105拷貝/ml［7］；103Eq/ml理論值時(shí)到達(dá)檢測(cè)極限［3］；PCRFP檢測(cè)HBVDNA的最低檢測(cè)出量1×101拷貝［2］；bDNA在105Eq/ml時(shí)到達(dá)檢測(cè)極限［3］。以上檢測(cè)限術(shù)語(yǔ)各不相同，且同一方法檢測(cè)HBVDNA在上述各實(shí)驗(yàn)室發(fā)出同樣的“HBVDNA低于檢測(cè)下限”的報(bào)告時(shí)其實(shí)際HBVDNA拷貝數(shù)相差可達(dá)100倍。

2FQPCR檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)介

以測(cè)定血清乙型肝炎病毒DNA為例：將40μl血清樣本加40μlDNA提取液處理后，將其中2μl加入主反應(yīng)液管中，在自動(dòng)熱循環(huán)上進(jìn)行溫度循環(huán)，自動(dòng)熱循環(huán)儀記錄每一反應(yīng)管在每一次溫度循環(huán)的熒光強(qiáng)度，記30次溫度循環(huán)后結(jié)束。在PCR循環(huán)過(guò)程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值。當(dāng)30次循環(huán)后某一待測(cè)管仍檢測(cè)不到高于基線水平的熒光信號(hào)時(shí)，儀器默認(rèn)Ct值為30，不計(jì)算起始拷貝。

3確定FQPCR檢測(cè)限的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理

如果被檢物的含量和檢測(cè)方法的空白響應(yīng)量的波動(dòng)服從正態(tài)分布規(guī)律，則檢測(cè)限可用多次檢測(cè)空白的方法來(lái)確定?？尚畔逓?5%時(shí)檢測(cè)限＝x空白+空白；可信限為%時(shí)檢測(cè)限=x空白+空白。這是目前多數(shù)檢測(cè)限的確定方法。對(duì)核酸檢測(cè)方法的檢測(cè)限的理解可能與此有差別，但是原理應(yīng)是一致的［1］，F(xiàn)QPCR檢測(cè)限也應(yīng)是推論總體與空白有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的最小抽樣結(jié)果。

4FQPCR檢測(cè)限的統(tǒng)計(jì)推斷

假設(shè)病原體在血液等體液中的分布是隨機(jī)的，則單位體積中(如μl)病原顆粒數(shù)的分布服從Poisson分布。以Poisson分布的概率函數(shù)公式計(jì)算一次抽樣檢測(cè)出現(xiàn)的結(jié)果推論總體概率。從理論上來(lái)說(shuō)，使用PCR測(cè)定技術(shù)測(cè)定病原體核酸序列的量可低至1個(gè)拷貝［2］。例如：血清標(biāo)本中加入等量的DNA提取液，于離心管中煮沸，4℃放置，離心，吸取上清液2μl作模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)(2μl上清液相當(dāng)于抽樣1μl血清)［2］，其中至少有1個(gè)拷貝的HBVDNA才能有典型擴(kuò)增反應(yīng)，這時(shí)檢測(cè)結(jié)果是1拷貝/μl。由Poisson分布的概率函數(shù)公式可計(jì)算出1次抽樣檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)0時(shí)，推斷總體為1～9的概率見(jiàn)表1。

表1總體為1～9時(shí)抽樣為0的概率及總體

在FQPCR檢測(cè)HBVDNA中，當(dāng)30次循環(huán)后某一待測(cè)管仍檢測(cè)不到高于基線水平的熒光信號(hào)(即當(dāng)Ct≥30)，反應(yīng)管檢測(cè)結(jié)果為0時(shí)，推論總體拷貝數(shù)為1～9的概率之和92，總體為其他的概率之和(此時(shí)報(bào)告0拷貝的可信限度低于50%)?？傮w為1時(shí)一次抽樣結(jié)果分別為1～9時(shí)的概率見(jiàn)表1。當(dāng)一次抽樣結(jié)果≥4時(shí)，推論總體為1的概率≤33，所以對(duì)于病原體的檢測(cè)，一次抽樣反應(yīng)管檢測(cè)結(jié)果≥4拷貝時(shí)，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性()。因而上述檢測(cè)血清中病原體時(shí)一次抽樣反應(yīng)管的檢測(cè)限是4拷貝/μl。當(dāng)總體為1、2、3時(shí)一次抽樣結(jié)果為0的概率分別是88、34、79。如室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣本靶值選擇1拷貝/μl、2拷貝/μl、3拷貝/μl時(shí)，無(wú)論實(shí)驗(yàn)室實(shí)際檢測(cè)質(zhì)量如何高，都將有%、%、%的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果為0而被判為不符合，而報(bào)告結(jié)果的單位是ml甚至L。當(dāng)總體為1拷貝/μl時(shí)表示一次抽樣結(jié)果為0的概率達(dá)，結(jié)果在0拷貝/μl～4拷貝/μl的概率為；而總體為1000拷貝/ml時(shí)表示一次抽樣結(jié)果為0的概率為0，結(jié)果在905拷貝/ml～1095拷貝/ml的概率為(Poisson分布總體50時(shí)近似正態(tài)分布，范圍是X±uα*√X，可信限為%時(shí)uα=3);總體為100000拷貝/L時(shí)表示一次抽樣結(jié)果在997000拷貝/L～1003000拷貝/L的概率為。文中推理以HBVDNA的FQPCR檢測(cè)為例，其他病源體核酸的FQPCR檢測(cè)也與其相同，檢測(cè)限是抽樣反應(yīng)管的檢測(cè)限4拷貝/反應(yīng)管；如反應(yīng)管中加入模板量相當(dāng)于μl血清則檢測(cè)限相當(dāng)于拷貝/μl。此推斷僅是針對(duì)FQPCR技術(shù)本身的檢測(cè)限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行討論。

【參考文獻(xiàn)】

［1］馮仁豐.分析靈敏度(檢測(cè)限)［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2002，17(3)：133134.

［2］郭晏海，張菊，趙錦榮，等.聚合酶鏈反應(yīng)熒光偏振技術(shù)在乙型肝炎病毒DNA檢測(cè)中的應(yīng)用及價(jià)值［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27(1)：2627.

［3］張東華，金根娣，陸志檬.二種分子雜交技術(shù)定量檢測(cè)臨床標(biāo)本中HBVDNA的比較［J］.上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2003，18(3)：163164.

［4］何敏，楊朝霞，劉微，等.HBVDNA定量檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005，26(2)：123124.

［5］劉停，韓亞萍，張永祥.熒光定量PCR檢測(cè)慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA及其意義［N］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23(1)：7879.

［6］黃希田，顏鳴鶴，凌喬，等.定量PCR微流芯片法定量檢測(cè)血清HBVDNA含量.中國(guó)感染控制雜志，2003，2(2)：8991.

［7］王豪，陶其敏，吳娟，等.兩種乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)方法的比較與評(píng)價(jià)［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2002，25(5)：318320.

［8］李金明，鄧巍，王露楠，等.PCR測(cè)定乙型肝炎病毒DNA弱陽(yáng)性質(zhì)控血清的適用性研究［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2000，18(1)：67.

［9］ManciniC,PisaniG,AzziA,etlabortorycomparisonofqualitativedetectionofhepatitisC(HCV)virusRNAindiagnosticvirology:amulticentestudy(MS)inItal