基因工程制藥工藝第1頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月第六章基因工程制藥工藝6.1基因工程制藥微生物表達(dá)系統(tǒng)6.2基因工程大腸桿菌的構(gòu)建6.3基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)與控制第2頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月6.3基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)與控制6.3.1培養(yǎng)基組成與控制6.3.2培養(yǎng)工藝與控制6.3.3產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)與終點控制第3頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月6.3.1培養(yǎng)基組成與控制營養(yǎng)與環(huán)境作用：碳源、氮源、無機(jī)鹽和生長因子工藝作用：消泡劑篩選與表達(dá)：選擇劑，誘導(dǎo)物第4頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月1、碳源大腸桿菌：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源。酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)。添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機(jī)物如甘油等對菌體生長具有一定的促進(jìn)作用。濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。葡萄糖優(yōu)先利用會造成培養(yǎng)基的酸化。第5頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月2、氮源直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機(jī)氮源。不同工程菌對氮源利用能力差別很大，具有很高的選擇性。大腸桿菌：利用大分子有機(jī)氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸為氮源。第6頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月3、無機(jī)鹽磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)?；蚬こ叹L提供必需的礦物質(zhì)。第7頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月4、選擇劑維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。兩類：營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)標(biāo)記和抗生素抗性選擇標(biāo)記發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒易丟失，使之成為宿主菌。為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不丟失，根據(jù)質(zhì)粒的標(biāo)記基因，添加或缺陷選擇劑。第8頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月基因工程大腸桿菌含有抗生素抗性基因，抗生素作為選擇劑：卡那霉素、氨芐青霉素、氯霉素、博來霉素等?；蚬こ探湍妇Ｓ冒被釥I養(yǎng)缺陷型，缺陷亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、色氨酸等。第9頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月5、誘導(dǎo)物誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌：在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達(dá)必不可少的。lac啟動子表達(dá)系統(tǒng)：IPTG誘導(dǎo)。甲醇營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。第10頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月6.3.2培養(yǎng)工藝與控制溫度溶解氧pH第11頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月1、溫度對工程菌生長的影響符合三基點原則：最低，最適，最高。大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度10℃。大腸桿菌生長最適溫度37℃，最高溫度45℃。釀酒酵母生長最適溫度30℃，最高溫度40℃。第12頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月生長與生產(chǎn)溫度不一致。較高溫度表達(dá)量大，易形成包涵體。策略：較低溫度下有利于表達(dá)可溶性蛋白質(zhì)。對于熱敏感的蛋白質(zhì)，高溫會降解破壞。策略：生產(chǎn)期可采用先高溫，然后低溫，變溫表達(dá)，避免蛋白質(zhì)降解。第13頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月兩端變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度。后期：較低溫度發(fā)酵，對菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標(biāo)產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導(dǎo)型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：生長期維持37℃，生產(chǎn)期提高溫度42℃。第14頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月2、pH值對發(fā)酵的影響細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜pH為6.5-7.5真菌喜歡微酸性：酵母適宜pH為5.0-6.0pH值影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn)pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸的產(chǎn)生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達(dá)。第15頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月了解發(fā)酵過程中各個階段的適宜pH以后，進(jìn)一步設(shè)法控制pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制pH：根據(jù)試驗結(jié)果來確定生長最適pH和產(chǎn)物最適pH，以達(dá)到最佳生產(chǎn)。第16頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月3、溶解氧工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。無氧呼吸會導(dǎo)致大量的能量消耗，同時產(chǎn)生有機(jī)酸，對細(xì)胞生長極為不利，甚至有毒害。從供應(yīng)量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力，在臨界溶解氧濃度之上。調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量。第17頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月6.3.3產(chǎn)物誘導(dǎo)與終點控制一般情況下，目標(biāo)產(chǎn)物對宿主是不利的常用策略：誘導(dǎo)表達(dá)根據(jù)啟動子類型和目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)的調(diào)控模式而定當(dāng)產(chǎn)率最大時，結(jié)束發(fā)酵。第18頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月在生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制適宜的誘導(dǎo)時間：非常重要誘導(dǎo)物的濃度及其發(fā)酵溫度，影響表達(dá)量，產(chǎn)物存在形式。第19頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月工程菌啟動子表達(dá)特點誘導(dǎo)條件大腸桿菌lac高度嚴(yán)謹(jǐn)控制蛋白的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)IPTG大腸桿菌T7高度嚴(yán)謹(jǐn)控制無毒蛋白的高水平表達(dá)IPTG大腸桿菌PL、PR高度嚴(yán)謹(jǐn)轉(zhuǎn)錄控制有毒蛋白的表達(dá)高溫（42℃）大腸桿菌phoA與信號肽序列融合，組成性分泌表達(dá)無需誘導(dǎo)釀酒酵母GAL高拷貝附加質(zhì)粒，嚴(yán)謹(jǐn)控制，分泌系統(tǒng)半乳糖畢赤酵母AOX1整合到染色體中，嚴(yán)謹(jǐn)控制，分泌表達(dá)甲醇畢赤酵母GAP組成性分泌表達(dá)無需誘導(dǎo)第20頁，課件共22頁，創(chuàng)作于2023年2月1、化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子：lac、tac、T7等誘導(dǎo)時間：對數(shù)生長期細(xì)菌：IPTG