基因治療生物化學1第1頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基因治療的類型

1.基因調(diào)控治療從基因水平調(diào)控缺陷基因表達，改善癥狀鐮型細胞貧血癥---用5-氮胞苷抑制甲基化酶，使因甲基化而關(guān)閉的γ基因重新開放，產(chǎn)生HbF代替HbA用反義RNA抑制基因表達核酶（ribozyme）切割RNA阻斷基因表達腫瘤治療，在基因水平抑制腫瘤細胞基因惡性表達和引導腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)。2第2頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月基因治療的類型（續(xù)）

2.基因矯正治療

基因增補—正常基因?qū)牖颊唧w內(nèi)補償缺陷基因功能基因替換—以正?；蛉〈儺惢蚧蛐Ｕw外對異?；蜻M行糾正。3第3頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月基因治療的類型（續(xù)）按矯正基因的類型分為兩種基因治療：

·生殖細胞基因治療

—對生殖細胞或早期胚胎細胞進行基因矯正。

·體細胞基因治療

—以體細胞為受體細胞，不影響下一代常用細胞介導法：選擇靶細胞在體外進行基因修飾，再將其輸入體內(nèi)。4第4頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月基因置換（genereplacement）

定義：將特定目的基因?qū)胩囟毎?，通過定位重組，導入的正?；?，以置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進行橋正。對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。5第5頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月定向整合的條件:轉(zhuǎn)導基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換?；蛲粗亟M技術(shù)又稱為基因打靶(genetargeting）細胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低。基因同源重組技術(shù)6第6頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月基因增補（geneaugmentation）

定義:通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。類型:有缺陷基因細胞中導入正?；颍毎麅?nèi)的缺陷基因并未除去，通過導入正?；虻谋磉_產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能；向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的。7第7頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月基因干預（geneinterference）基因失活

定義：采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。8第8頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）反義RNA（antisenseRNA）

1.反義RNA與基因表達調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調(diào)控，通常采用的方法有兩種：

（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。9第9頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)①受體介導的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層,可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。借助前述的受體介導基因轉(zhuǎn)移方法，可以實現(xiàn)受體介導的反義RNA轉(zhuǎn)移。10第10頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月反義RNA的優(yōu)點

受體介導的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。

（l）安全性高（2）反義RNA設(shè)計和制備方便

（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應

（4）能直接作用于一些RNA病毒11第11頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶(ribozyme)

天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當?shù)牟课?，形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子而達到治療疾病的目的。

12第12頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月核酶錘頭狀的二級、三級結(jié)構(gòu)只要兩個RNA分子通過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應。目錄13第13頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月1.核酶的設(shè)計核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶。

（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導序列。14第14頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月干擾RNA

1.RNA干擾現(xiàn)象RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。有義RNA（senseRNA）或反義RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數(shù)量級。

15第15頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月2.RNA干擾的機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。16第16頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月研究基因功能的新工具

由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。

RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段。

17第17頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月1.體外化學合成;2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA的產(chǎn)生18第18頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷毎?，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。應用：是惡性腫瘤基因治療的主要方法。（四）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)19第19頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月

（五）基因免疫調(diào)節(jié)通過將抗癌免疫增強的細胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。20第20頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基因治療的條件

·對導入的基因及其產(chǎn)物有詳盡了解；

·外源基因有效導入受體細胞、穩(wěn)定整合、適量表達；

·不影響受治細胞基因組及表達調(diào)控；

導入基因方法安全，載體對靶細胞無害；21第21頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基因治療的原則對象是病情嚴重、預后差、別無他法的患者轉(zhuǎn)移的基因被克隆無需高水平表達和精確定量控制就有治療效果靶細胞獲取或回輸安全轉(zhuǎn)移基因表達對細胞微環(huán)境無嚴格特異性要求22第22頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月四、基因療法的步驟

目的（治療）基因的選擇根據(jù)基因治療類型選擇相應目的基因（增補、替換、添加）基因載體的構(gòu)建使目的基因在受體細胞內(nèi)高效、可控、穩(wěn)定地表達

受體細胞選擇易分離獲取，體外增殖存活，大量擴增。如成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓造血干細胞23第23頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)方法

1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移2.非病毒介導的基因轉(zhuǎn)移24第24頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移效率較高據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。25第25頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒

26第26頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）腺病毒(adenovirus)載體

通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。27第27頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月常用基因治療載體

整合致病性感染細胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機整合，效率高可能致病分裂細胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細胞、非分裂細胞

腺相關(guān)病毒載體定點整合(19號染色體特定區(qū)域)不致病分裂細胞、非分裂細胞<5kb<7.5kb28第28頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月2.非病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉?；驹?利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。

29第29頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。30第30頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）基因直接注射技術(shù)

不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應的蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。

將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子Ⅸ。31第31頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月

基因直接注射法的優(yōu)點制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易；排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；導入的基因不需整合即可表達，避免了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點；基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內(nèi)免疫應答，致使反復治療效果下降。

32第32頁，課件共34頁，創(chuàng)作于2023年2月五、基因治療的應用治療惡性腫瘤

治療黑色素瘤--將已導入IL2基因的TIL細胞回輸給病人，啟動自身免疫治療艾滋病--用射線照射已導入HIV基因的成纖維細胞，細胞停止分化，但能產(chǎn)生gp160，將細胞回輸給病人，能激活免疫系統(tǒng)，殺傷HIV感染細胞。治療家族性高膽固醇血癥（FH）

肝細胞低密度脂蛋白（LDL）受體基因混亂造成，將LDL基因?qū)氩∪穗x體培養(yǎng)的肝細胞，然后經(jīng)導管注入門脈循環(huán)，進入肝細胞后表達相應功能蛋白