氨基酸分離的主要技術(shù)及原理林錦池董越范雪雪摘要：本文對氨基酸分離提純常用的沉淀法、離子交換法、萃取法、吸附法、毛細電滲析法、膜分離法以及結(jié)晶法等方法的技術(shù)原理及研究進行較全面的總結(jié)。1沉淀法沉淀法是最古老的分離、純化方法，目前仍廣泛應(yīng)用在工業(yè)上和實驗室中。它是利用某種沉淀劑使所需要提取的物質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的過程。該方法具有簡單、方便、經(jīng)濟和濃縮倍數(shù)高的優(yōu)點。氨基酸工業(yè)中常用沉淀法有等電點沉淀法，特殊試劑沉淀法和有機溶劑沉淀法。1.1利用氨基酸的溶解度分離或等電點沉淀法在生產(chǎn)中常利用各種氨基酸在水和乙醇等溶劑中溶解度的差異，將氨基酸彼此分離。如胱氨酸和酪氨酸在水中極難溶解，而其它氨基酸則比較易溶；酪氨酸在熱水中溶解度大，而胱氨酸則無大差別。根據(jù)此性質(zhì)，即可把它們分離出來，并且互相分開。另外，可以利用氨基酸的兩性解離有等電點的性質(zhì)。由于氨基酸在等電點時溶解度最小，最容易析出沉淀，所以利用溶解度法分離氨基酸時，也常結(jié)合等電點沉淀法。1.2特殊試劑沉淀法某些氨基酸可以與一些有機或無機化合物結(jié)合，形成結(jié)晶性衍生物沉淀，利用這種性質(zhì)向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀劑，使目標氨基酸與沉淀劑沉淀下來，達到與其它氨基酸分離的目的。較為成熟的工藝有：纈氨酸與苯甲醛在堿性和低溫條件下，可縮合成溶解度很小的苯亞甲基精氨酸，分離這種沉淀，用鹽酸水解除去苯甲醛，即可得精氨酸鹽酸鹽；亮氨酸與鄰一二甲苯一4一磺酸反應(yīng)，生成亮氨酸的磺酸鹽，后者與氨水反應(yīng)得到亮氨酸；組氨酸與氯化汞作用生成組氨酸汞鹽的沉淀，再經(jīng)處理就可得到組氨酸。特殊試劑沉淀法雖然操作簡單、選擇性強，但是由于沉淀劑回收困難，廢液排放污染嚴重，殘留沉淀劑的毒性等原因已逐漸被它方法取代。工業(yè)應(yīng)用舉例：選擇性沉淀分離亮氨酸、精氨酸的方法該方法包括下述步驟：將二氯苯磺酸加入到毛發(fā)酸水解液中，所述二氯苯磺酸和所述水解液之間的重量/體積比為二氯苯磺酸：水解液=1：5?20；攪拌所述毛發(fā)酸水解液；將生成的亮氨酸沉淀物進行分離以獲取亮氨酸。選擇性沉淀分離精氨酸的方法：將分離亮氨酸沉淀物后的水解液按一定比例補加上述二氯苯磺酸，連續(xù)攪拌12?36小時，將生成的精氨酸沉淀物進行分離以獲取精氨酸。2離子交換法離子交換法是利用不溶性高分子化合物（即離子交換樹脂）對不同氨基酸吸附能力的差異對氨基酸混合物進行分組或?qū)崿F(xiàn)單一成分的分離。離子交換樹脂是一種具有離子交換能力的高分子化合物。它不溶于水、酸和堿，也不溶于普通有機溶劑，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。離子交換樹脂作為固定相，本身具有正離子或負離子基團，和這些離子相結(jié)合的不同離子是可電離的交換基團（或稱功能基團）。在離子

交換過程中，溶液中的離子自溶液中擴散到交換樹脂的表面，然后穿過表面，又擴散到交換樹脂顆粒內(nèi)，這些離子與交換樹脂中的離子互相交換，交換出來的離子擴散到交換樹脂表面外，最后再擴散到溶液中去。這樣，當(dāng)溶液和樹脂分離后,其組成都發(fā)生了變化，從而達到分離純化的目的。在生產(chǎn)中，在適當(dāng)?shù)膒H條件下,如在pH=5?6的蛋白質(zhì)水解液中，堿性氨基酸解離成陽離子，酸性氨基酸就解離成陰離子，而中性氨基酸基本上呈電中性。選擇適當(dāng)?shù)慕粨Q樹脂，就能實現(xiàn)單一的或者分組的選擇性吸附。然后用不同pH的洗脫液，可把各種氨基酸分別洗脫下來。離子交換法提取氨基酸處理量大，工藝較成熟。但由于該法是利用各種氨基酸之間等電點的差異，所以只有當(dāng)欲被分離的混合氨基酸之間的等電點相差較大時才能較好的分開，對于等電點相近的混合氨基酸只能部分得以分開或根本就難以分離。另外，氨基酸離子在樹脂中的擴散速度較慢，因此一方面要求料液的流速較低，另一方面對于氨基酸濃度較高的料液在上離子交換柱前還要進行稀釋，這就必然導(dǎo)致所需的設(shè)備太大。應(yīng)用舉例：加樣平衡液陽離子交換樹脂尼龍網(wǎng)—或砂芯濾板收集收集高離子強度

洗液收集高離子強度

洗液收集加樣平衡液陽離子交換樹脂尼龍網(wǎng)—或砂芯濾板收集收集高離子強度

洗液收集高離子強度

洗液收集離子交換柱層析原理示意分離步驟：1.樹脂的處理將干的強酸型樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時，傾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處理，做法同上。最后用欲使用的緩沖液浸泡。2?裝柱取直徑1cm,長度10—12cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂部注入上述經(jīng)處理的樹脂懸浮液，關(guān)閉層析柱出口，待樹脂沉降后，放出過量溶液，再加入一些樹脂，至樹脂沉降至8~10cm的高度即可。3?平衡將緩沖液瓶與恒流泵相連，恒流泵出口與層析柱入口相連，樹脂表面保留3—4cm液層，開動衡流泵，以24ml/h流速平衡，直至流出液pH與洗脫液相同。加樣揭去層析柱上口蓋子，待柱內(nèi)液面至樹脂表面1—2mm關(guān)閉出口，沿管壁四周小心加入0.5ml樣品，慢慢打開出口，同時開始收集流出液。當(dāng)樣品液彎月面靠近樹脂頂端時，即刻加入少量檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處數(shù)次，然后注入檸檬酸緩沖液至液面高3—4cm左右，接恒流泵。洗脫以緩沖液洗脫，開始用試管收集洗脫液，每管收集1mL，共收集60—80管。3萃取法1反應(yīng)萃取反應(yīng)萃取就是選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)萃取劑，其解離出來的離子與氨基酸解離出來的離子發(fā)生反應(yīng)，生成可以溶于有機相的萃取配合物，從而使氨基酸從水相進入有機相。由于萃取劑與不同的氨基酸反應(yīng)形成性質(zhì)不同的萃合物，擴大了那些性質(zhì)相近的氨基酸的性質(zhì)差別，從而達到彼此分離和提純的目的。迄今為止，人們采用了兩種不同形式的反應(yīng)萃取劑，一類是在低pH值下萃取氨基酸陽離子，以酸性磷氧類萃取劑最為典型，如二（2-乙基己基）磷酸、十二烷基磷酸、十二烷基苯磺酸等。且當(dāng)這些萃取劑中添加諸如煤油、四氯化碳、苯、正辛烷、異戊醇時可增加分相速度。另一種是在高pH值下萃取氨基酸陰離子、季銨鹽，如甲基三辛基氯化銨是典型的陰離子萃取劑。3.2溶劑萃取由于氨基酸是離子型化合物，它們在非極性溶劑中的溶解度很低，因此物理萃取法難以用來提取氨基酸。早期采用正己胺和含4?5個碳原子的低級醇作為萃取劑從蛋白水解液中萃取分離十幾種氨基酸。但這種萃取劑的分配系數(shù)低，分離系數(shù)差，對萃取柱的高度要求很高，一般要有30?40理論級才能有滿意的分離效果。近些年來先后開發(fā)了化學(xué)萃取法分離提取氨基酸，其中有機胺類和以有機磷酸為應(yīng)用最多的兩大類萃取劑，尤其是在有機磷酸為萃取劑的萃取過程研究很多，并開發(fā)大量的工藝過程。采用高級脂肪酸，如月桂酸、硬脂酸、棕櫚酸和油酸可以有效地萃取分離堿性氨基酸。這些脂肪酸無毒、價廉。但是，堿性氨基酸比較容易用離子交換法有效地分離。萃取法分離堿性氨基酸恐怕難有商業(yè)應(yīng)用前景嗍。利用氨基酸不溶于水，而易溶于液氨的性質(zhì)，發(fā)展了液氨萃取技術(shù)。應(yīng)用這種技術(shù)，在蒸發(fā)了氨后，可獲得氨基酸的極好結(jié)晶?；瘜W(xué)萃取法分離混合氨基酸主要也是利用不同氨基酸之間等電點差別，與離子交換法相似，只有當(dāng)混合氨基酸之間的等電點相差足夠大時才能被萃取分離開，對于等電點相近的氨基酸如中性氨基酸，它們的等電點幾乎一致，因此化學(xué)萃取法是難以分離混合中性氨基酸的。3.3反向微膠團萃取反向微膠團是溶在有機溶劑中的表面活性劑自發(fā)形成的納米級的一種聚體，表面活性劑的極性尾在外與非極性的有機溶劑接觸，而極性頭則排列在內(nèi)形成極性核，極性核溶于水后就形成了“水池”。當(dāng)含有氨基酸的水溶液與含反相微膠團的有機溶劑相混合時，氨基酸以帶電離子狀態(tài)進入反相微膠團的“水池”內(nèi)或微膠團球粒的界面分子膜層內(nèi)而被分離。反相微膠團對氨基酸具有相當(dāng)強的萃取能力。氨基酸是以離子狀態(tài)被萃取的，不同帶電狀態(tài)的氨基酸離子的被萃取能力不同。pH變化對氨基酸萃取分配比的影響是通過改變氨基酸在水溶液中的電離狀態(tài)而影響氨基酸的總分配比的。水溶液中的離子強度變化則是影響氨基酸離子與表面活性劑之間的靜電作用強弱來影響氨基酸的被萃取能力的。反相微膠團對氨基酸的萃取由于反萃用的是離子強度更大的鹽溶液，所以反萃液尚需進一步將氨基酸與無機鹽分離，才能得到純的氨基酸。到目前為止大多數(shù)研究的只是適用于低鹽濃度的氨基酸料液如發(fā)酵液，對于同時含有多種氨基酸且鹽濃度高的料液如胱氨酸母液則不能適用。3.4液膜萃取液膜萃取，也稱液膜分離，是將第三種液體展成膜狀以便隔開兩個液相，利用液膜的選擇透過性，使料液中的某些組分透過液膜進入接受液，然后將三者各自分開，從而實現(xiàn)料液組分的分離.液膜分離過程是由三個液相所形成的兩個相界面上的傳質(zhì)分離過程，實質(zhì)上是萃取與反萃取的結(jié)合液膜萃取兼有溶劑萃取和膜滲透兩項技術(shù)的特點，按其結(jié)構(gòu)可分為乳化液膜和支撐液膜兩大類。乳化液膜為液體表面活性劑形成的球面，將溶液分為內(nèi)相和外相，液膜只有幾個分子厚，單位體積設(shè)備的表面積可達1000?3000m2/m3。乳狀液膜萃取法提取氨基酸是一種具有工業(yè)應(yīng)用前景的分離氨基酸的新方法，它具有膜分離技術(shù)的優(yōu)點，在常溫下操作，能耗少，又不象固體膜需要高壓操作，存在膜污染老化而需經(jīng)常清洗、維修和更換的麻煩。但是，目前大多數(shù)研究仍處于實驗室階段，未見工業(yè)報道。乳狀液膜萃取法要實現(xiàn)工業(yè)化，還必須研究解決萃取過程的乳化問題、低毒萃取劑的選擇和萃取劑殘留物對產(chǎn)品質(zhì)量影響的問題及萃取平衡和傳質(zhì)速率問題。支撐液膜是將起分離作用的液相借助毛細作用同定在多孔高分子膜中，由載體、有機溶劑（或稱稀釋劑）和多孔高分子膜（或稱支撐體）三個組分組成，其體系由料液、支撐液膜和反萃取液三個連續(xù)相組成，支撐液膜可以使萃取與反萃取在液膜的兩側(cè)同時進行，從而避免載體負荷的限制、減少了有機相的使用量，解決了乳化液膜的乳化液穩(wěn)定條件及破乳等問題。而且支撐液膜因其結(jié)構(gòu)簡單的特點，可用于研究確定傳遞機理。工業(yè)應(yīng)用舉例：翁連進以二異辛基磷酸銨表面活性劑形成的反膠團，在鹽濃度高達4.5M的胱氨酸母液中萃取精氨酸的分配系數(shù)可以達到3.8,通過改變混合氨基酸水溶液中無機鹽的種類或濃度，使等電點相近的氨基酸在同一種反膠團中的分配系數(shù)產(chǎn)生較大的差別，實現(xiàn)等電點相近的混合氨基酸的分離。根據(jù)這一觀點，翁連進已經(jīng)成功地開發(fā)了從胱氨酸母液中提取精氨酸的工藝，該工藝采用4級萃取,3級洗滌，可使反膠團中精氨酸的純度大于98%，整個工藝精氨酸的回收率大于98%，大大高于目前工業(yè)上應(yīng)用離子交換法從胱氨酸母液中提取精氨酸的回收率。4吸附法吸附法是利用恰當(dāng)?shù)奈絼?，在一定的pH條件下，使混合液中氨基酸被吸附劑吸附，然后再用適當(dāng)?shù)南疵搫⑽降陌被釓奈絼┥辖馕聛恚_到濃縮和提純的目的。常用的吸附劑有高嶺土、氧化鋁、酸性白土等無機吸附劑。吸附法具有很多優(yōu)點，如：不用或少用有機溶劑；操作簡便、安全，設(shè)備簡單；吸附過程pH變化小等。但是吸附法的選擇性差，收率低，特別是一些無機吸附劑性能不穩(wěn)定，不能連續(xù)操作，勞動強度大，尤其活性炭影響環(huán)境衛(wèi)生。所以吸附法曾有一段時間很少采用，幾乎被其它方法所代替。但隨著大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑的合成和不斷發(fā)展，吸附法又重新被人們重視。工業(yè)應(yīng)用舉例：活性炭吸附分離芳香族氨基酸方法：活性炭對芳香族氨基酸有選擇性吸附特性，可將芳香族氨基酸從寡肽混合液中分離出來易于實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用而成為首選。活性炭吸附芳香族氨基酸的作用力是非極性苯環(huán)側(cè)鏈與活性炭巨大表面積間的非極性吸附和氨基酸極性基團與活性炭含氧基團間極性吸附的總和.吸附過程同時存在物理吸附和化學(xué)吸附.但以前者為主。水解工藝流程：雞蛋 預(yù)處理 雙酶二步酶水解」〉脫鹽「活性炭吸附」＞濃縮高F值寡肽混合物。吸附條件為pH3,吸附溫度25°C,炭-液比1B12，吸附時間120min。根據(jù)活性炭吸附前后的蛋清寡肽混合物溶液的全波長紫外掃面結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性炭對芳香族氨基酸吸附作用較強。經(jīng)氨基酸自動分析儀測得蛋清高F值寡肽溶液F值為22,游離氨基酸含量718%，凝膠過濾色譜測定其分子質(zhì)量分布為連續(xù)的，絕大部分分布在300~800u。5膜分離法膜分離法可以實現(xiàn)混合溶液的分離是因為在膜和溶液的界面處存在以下機理：由于親水性等原因所引起的選擇性透過效應(yīng)；與分子尺寸有關(guān)的篩分效應(yīng)；膜與氨基酸的電荷效應(yīng)。在大部分氨基酸的膜分離研究中，pH都是最重要的考察參數(shù)。因為氨基酸為兩性物質(zhì)，不同pH下的解離狀態(tài)不同，所帶的電荷數(shù)不同。此外溶液的pH還會影響到膜上離子基因所帶的電荷性質(zhì)。若膜上的離子基團帶負電荷，它能吸引和通過帶正電荷的陽離子，而排斥帶負電荷的陰離子；而帶正電荷的膜則允許帶負電荷的離子通過。在特定的分離要求下，選擇適當(dāng)類型的膜以及最佳的pH條件就成了決定分離效果好壞的關(guān)鍵。選擇膜時應(yīng)盡量同時使更多的分離機理起作用，以提高分離的選擇性。工業(yè)應(yīng)用舉例：國外膜分離工藝已應(yīng)用于乳制品工業(yè)。采用反滲透濃縮乳清，使用超濾法從乳清中制備濃縮蛋白質(zhì)，使用微米膜分離乳清中的蛋白質(zhì)、去除脫脂乳中的細菌,使用納濾膜去除乳清中的礦物質(zhì)。近些年，又開始研究膜過濾分離蛋白質(zhì)、肽和氨基酸的可行性。在人體的新陳代謝過程中存在大量生物膜滲透現(xiàn)象。研究氨基酸的膜分離不僅可以找出有效的生物分離技術(shù)，而且有助于加深對這些新陳代謝過程的理解。國內(nèi)還處于研究階段，例如：營愛玲［251等利用NTR7450荷電納濾膜，將溶液的pH值調(diào)為5—8,可以對L一丙氨酸和L一天冬氨酸進行了成功的分離。李書良等采用納濾膜分離發(fā)酵液中的谷氨酰胺，研究了不同pH條件下發(fā)酵液中谷氨酸和谷氨酰胺的透過特性，當(dāng)pH=7時，納濾膜分離谷氨酰胺的提取收率可達65%以上。6結(jié)晶法結(jié)晶是純化物質(zhì)的有效手段。發(fā)酵液和提取液采用上述方法進行初步的分離提取之后，要得到具有一定粒度分布和晶體形狀的成品還必須對其進行濃縮結(jié)晶和重結(jié)晶。這也是決定最終產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。醫(yī)藥用輸液氨基酸必須具有較高的純度，這就要求結(jié)晶產(chǎn)品具有較大的粒度，以便于與母液分離；較小的晶體也易于形成聚結(jié)體，夾雜母液，降低產(chǎn)品的純度。發(fā)酵法除了得到目標氨基酸外，還會產(chǎn)生與目標氨基酸結(jié)構(gòu)相似的其它氨基酸。通常，在有機物的結(jié)晶過程中，若雜質(zhì)分子與待結(jié)晶物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)相似，即使雜質(zhì)濃度很低，也會對晶體的成長和晶習(xí)產(chǎn)生很大影響。氨基酸分子由親水的極性基和疏水的非極性基構(gòu)成，這決定了氨基酸晶格的不對稱性以及各晶面極性的差異性，進而導(dǎo)致結(jié)晶過程中不同晶面處固液界面性質(zhì)（如界面張力、吸附性質(zhì)、荷電性、潤濕性等）的差異。這些因素會導(dǎo)致在不同溶劑、溫度及雜質(zhì)濃度條件下成核特性和不同晶面生長特性的復(fù)雜性和不確定性，這也是氨基酸結(jié)晶過程中產(chǎn)品晶型難以控制、甚至出現(xiàn)無定形的內(nèi)在原因。為了得到具有特定粒度分布、主粒度和晶型的氨基酸晶體產(chǎn)品，必須對氨基酸結(jié)晶的整個過程進行良好的控制。多數(shù)氨基酸能溶于水，難溶于有機溶劑。其在水溶液中的溶解度和存在狀態(tài)受pH的影響很大。相比之下，L-脯氨酸、L-精氨酸、L-精氨酸鹽酸鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-鳥氨酸鹽酸鹽在水中的溶解度較大；L-丙氨酸、L-蘇氨酸、L-組氨酸的溶解度適中，且隨溫度變化不明顯。L-胱氨酸和L-色氨酸在水中的溶解度較小。在已知溶解度的基礎(chǔ)上選擇適當(dāng)?shù)慕Y(jié)晶方法，并使溶液過飽和度在整個結(jié)晶過程中維持在一個較低的水平。過高的過飽和度會使雜質(zhì)分子嵌入到晶格降低產(chǎn)品純度，而且會增加二次成核的幾率。在考慮成核影響的基礎(chǔ)上運用程序降溫的系統(tǒng)方法，可以有效地抑止二次成核。對于間歇冷卻法生產(chǎn)氨基酸具有一定的指導(dǎo)意義。在工業(yè)結(jié)晶中，生物產(chǎn)品的多晶型現(xiàn)象必須給予足夠的重視。因為許多情況下，只有特定的晶體形態(tài)才具有藥理作用。對于多晶型現(xiàn)象最有可能的解釋為，何種晶型最先出現(xiàn)是由穩(wěn)定形態(tài)和較穩(wěn)定形態(tài)晶體的相對成核和成長速率決定的，也就是說動力學(xué)因素起決定作用。工業(yè)應(yīng)用舉例：結(jié)晶方法在工業(yè)上生產(chǎn)L-谷氨酸：谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酸的工藝流程如下:分離步驟：發(fā)酵后，發(fā)酵液呈不太粘稠的液體，PH值為6.0?7.0,谷氨酸含量4%?8%。待發(fā)酵后，應(yīng)立即進行谷氨酸提取。在提取谷氨酸之前應(yīng)先進行菌體的分離。將發(fā)酵液放入等電罐中攪拌冷卻，加入菌體細麩酸，并使降溫至3?5°C,加演算調(diào)PH值。前期加酸速度稍快，lh左右將發(fā)酵液的PH值調(diào)至5.0,中期加酸要慢，經(jīng)過2h將PH值調(diào)至4.0?4.5，停止加酸，育晶1?2h,然后加酸使PH值調(diào)至谷氨酸等電點3.0?3.2。然后攪拌12?14h，使晶體