第二節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄后加工RNA成熟轉(zhuǎn)錄后加工（post-transcriptionalprocessing）

1整理ppt一原核生物中RNA的加工：（一）原核生物rRNA前體加工：pppA6500nt2整理ppt（二）原核生物tRNA前體加工：

1.tRNA前體兩側(cè)切斷(cutting)及修剪(trimming)：1）5’tRNA成熟酶——RNasePRNaseP蛋白：20kDaRNA（M1RNA）：ribozymeRNaseP是識別RNA特定空間結(jié)構(gòu)而非一級結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶2）tRNA3’-端：切割——RNaseF成熟——RNaseD3整理ppt2.tRNA3’-末端CCAOH結(jié)構(gòu)的形成：

（1）自身含有-CCAOH結(jié)構(gòu)，經(jīng)過修剪后暴露。（2）由tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化形成-CCAOH：tRNA+2CTP+ATPtRNA-CCAOH+3PPi3.tRNA分子中核苷酸修飾和異構(gòu)化：例如：假尿嘧啶（）的形成（U糖苷鍵移位，N1

C5）

4整理ppt切除tRNA前體兩端多余的序列：

5’—端切除幾到10個核苷酸。b、末端添加：3’-端添加CCA序列。c、修飾：形成稀有堿基如DH2。RNAasePRNAasePRNAaseFRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC核酸內(nèi)切酶的作用核苷酰轉(zhuǎn)移酶的作用

核酸外切酶的作用

異構(gòu)化酶的作用

5整理ppt（三）原核生物mRNA前體加工：細菌的mRNA大多數(shù)不需要加工，邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯。

少數(shù)如核糖體蛋白L10和L7/L12和RNA聚合酶的和’亞基組成多順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，需要經(jīng)RNaseIII切割后分別翻譯6整理ppt

細菌mRNA的特點：①多順反子：一個mRNA可以翻譯出不止一個蛋白產(chǎn)物②半衰期短：mRNA降解在轉(zhuǎn)錄開始后1min就開始了mRNA平均半衰期為2min（脊椎動物3hr)③5’端無帽子結(jié)構(gòu)，3’端只有較短的polyA結(jié)構(gòu)④起始密碼上游7~12bp處有一個SD序列（Shine-Dalgarnosequence)，與核糖體小亞基16SrRNA3’端互補7整理ppt二真核生物RNA的一般加工：（一）真核生物rRNA前體加工：真核生物rRNA前體合成、加工及核糖體裝配都在核仁中進行。受核仁小分子RNA（snoRNA）指導真核生物rRNA基因無內(nèi)含子，有也不被轉(zhuǎn)錄。5SrRNA基因簇RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄加工5S真核生物rRNA基因成簇排列：

32S(2.1106）28S(1.7106）45S41S5.8S(5104）20S(0.9106）18S（0.65106）

由RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄8整理ppt（二）真核生物tRNA前體加工：真核生物tRNA基因也是成簇排列，由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄。真核生物tRNA基因：約1300個果蠅tRNA基因：約850個大腸桿菌tRNA基因：約60個5’-tRNA成熟酶類似于原核生物RNaseP（但其中的RNA不是ribozyme），3’-端需要多種酶。真核生物tRNA自身不含有-CCAOH結(jié)構(gòu)，全部由tRNA核苷酰轉(zhuǎn)移酶催化合成。甲基化、假尿嘧啶化9整理ppttRNA的初級產(chǎn)物(4.8S，100Nt)成熟tRNA(4S，70-80Nt)加工內(nèi)切酶外切酶連接酶10整理ppt（三）真核生物mRNA前體加工：真核生物基因是斷裂基因（interruptedgene）1977年Roberts和Sharp提出，1993年Nobel醫(yī)學/生理學獎?wù)婧松飉RNA為單順反子，含有內(nèi)含子。內(nèi)含子（intron)：在RNA拼接時被切除的序列，不表達也稱為間隔序列（interveningsequence,IVS)外顯子（exon)：成熟RNA中出現(xiàn)的序列部分真核編碼蛋白的mRNA內(nèi)含子基因結(jié)構(gòu)特征：GT-AG規(guī)律即：mRNA內(nèi)含子的5’–端都是GU；而3’–端都是AG11整理ppt核內(nèi)不均一RNA（heterogenousnuclearRNA，hnRNA)：

核內(nèi)加工過程中mRNA前體形成的分子量大小不一的中間物。也稱為D-RNA。

hnRNA半壽期多數(shù)很短，幾分鐘至幾小時。而細胞質(zhì)中的mRNA壽命較長，1~10hr12整理ppt2.真核生物mRNA加工的一般步驟：（1）5’帽子的形成（capping）:

5’帽子：真核生物mRNA5’–末端特征結(jié)構(gòu)，是在mRNA5’–末端反向接上的一個甲基化的鳥苷酸。典型5’帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNpN…（Cap0）m7GpppNmpN…（CapI）m7GpppNmpNmpN…（CapII）m7G：G堿基7位甲基化；Nm：核糖2’-OH甲基化5’帽子功能：穩(wěn)定mRNA，不被5’核酸外切酶水解；翻譯起始的識別功能；有助于mRNA轉(zhuǎn)運13整理ppt加5’帽子的方法

capI結(jié)構(gòu)RNA三磷酸酶鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶鳥嘌呤7-甲基轉(zhuǎn)移酶2’-O-甲基轉(zhuǎn)移酶14整理ppt

（2）3’尾巴的形成（tailing）:

3’尾巴：真核生物mRNA的3’–端大都有20–200個腺苷酸構(gòu)成的polyA長鏈。形成于核內(nèi)加工時期。作用：穩(wěn)定3’-端，mRNA的polyA尾巴越長，可供降解的時間越長，壽命越長。與核內(nèi)向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移有關(guān)。不是所有真核生物蛋白mRNA都有polyA尾巴，如組蛋白15整理ppt真核生物的mRNA在3’–端存在保守的加尾信號（AAUAAA）RNaseIII識別加尾信號，在其下游10~30Nt處切斷，mRNA脫落。由多聚腺苷酸聚合酶加上20~200Nt的polyA尾巴。RNaseIII多聚腺苷酸聚合酶mRNARNA聚合酶II

3’尾巴的形成:16整理ppt（3）mRNA的內(nèi)部甲基化：

m6A，在hnRNA加工中起識別作用，不是翻譯所必需。（4）內(nèi)含子的切除及RNA拼接：

核內(nèi)小分子RNA與拼接體17整理ppt三.RNA拼接：真核RNA的內(nèi)含子切除以及拼接等方式是多樣化的是基因表達調(diào)控的一個重要方面1）類型I自我拼接(groupIself-splicing)2）類型II自我拼接(groupIIself-splicing)3）核mRNA的拼接體的拼接(nuclearmRNAspliceosomal)4）核內(nèi)tRNA前體的酶促拼接(nucleartRNAenzymatic)5）反式拼接（trans-splicing)6）選擇性拼接（alternativesplicing)

18整理ppt1）類型I自我拼接（groupIself-splicing)：1983年，CechT發(fā)現(xiàn)。1989年獲得Nobel化學獎嗜熱四膜蟲26srRNA前體（413Nt），在成熟過程中無需酶的催化，但需5’-GMP和Mg2+,是由其IVS(內(nèi)含子）自我催化完成的。

5’-GMP3’5’

OH

G5’3’

(G-IVS)

G

Mg2+

Mg2+

L19-IVS(395nt)兩次環(huán)化切除19nt5’3’19整理ppt2）類型II自我拼接（groupIIself-splicing)1982，AltmanS。1989年獲得Nobel化學獎II型內(nèi)含子（RNAaseP的M1RNA)在催化剪接反應(yīng)時不需要鳥苷酸，但需要Mg2+5’3’3’A2’-OH

Mg2+5’OH3’A2’-OH3’

Mg2+5’3’+A2’-OH3’OH20整理ppt3)核mRNA拼接體拼接

（nuclearmRNAsplicesomalsplicing)真核生物hnRNA的拼接是由核內(nèi)小分子RNA（snRNA）來承擔。snRNA：100-300個Nt的RNA，U含量高的稱為U系列snRNA。其中除了U3以外，U1–

U6都參與hnRNA的加工。拼接體（splicesome）：snRNA與蛋白構(gòu)成核糖核蛋白（snRNP），并組裝成為50-60S的橢球體。21整理pptCAUUCAUAUGAUGU外顯子1外顯子2GUAAGUAUACUACAAG5’3’內(nèi)含子U1U2

拼接體（splicesome）分支點拼接體22整理ppt

真核生物mRNA的拼接過程

拼接體識別、結(jié)合hnRNA內(nèi)含子5’及3’區(qū)域外顯子靠近，形成套索RNA(lariatRNA)

兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，切去內(nèi)含子，連接外顯子23整理ppt4)核內(nèi)tRNA前體的酶促拼接

（nucleartRNAenzymaticsplicing)催化酵母tRNA前體拼接的酶識別的不是內(nèi)含子的序列，而是特定的二級結(jié)構(gòu)內(nèi)含子外顯子1外顯子2核酸內(nèi)切酶2’,3’環(huán)磷鍵+5’-OH環(huán)磷酸二酯酶激酶+ATPA-P-PP2’3’OHP2’3’OHP2’3’P3’P連接酶磷酸酯酶24整理ppt5）反式拼接：順式拼接：分子內(nèi)的拼接反式拼接：生物體內(nèi)存在的分子間的拼接方式。較少見

例如：錐蟲的多種mRNA-GU-A-AGmRNA前導序列-A-AGGU|右側(cè)內(nèi)含子左側(cè)內(nèi)含子25整理ppt6）選擇性拼接（alternativesplicing)

：選擇性拼接（alternativesplicing)

：在不同發(fā)育階段或不同組織器官中，mRNA以不同的方式拼接。同源蛋白：經(jīng)選擇性拼接得到的不同蛋白產(chǎn)物。例如：降鈣素和降鈣素基因相關(guān)肽

polyApolyA腦中腎上腺1-2-3-4（降鈣素）1-2-3-56（降鈣素基因相關(guān)肽）exon12345626整理ppt②哺乳動物載脂蛋白B（ApoB）：在肝臟正常合成ApoB100。而在小腸中，CU，導致終止密碼UAA出現(xiàn)，肽鏈合成提前終止，合成ApoB48。RNA編輯：改變RNA編碼序列的方式RNA編輯類型：多種①U的插入與刪除：指導RNA(guideRNA,gRNA)為模板的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。例如：錐蟲線粒體mRNA插入4個U，校正了基因-1移碼突變四RNA編輯（RNAediting）與化學修飾：3’5’UUU-OHUU3’UUUUU5’OH3’5’U第一次轉(zhuǎn)酯第二次轉(zhuǎn)酯③腦Glu受體亞基mRNA：AI，多個GlnArgRNA編輯意義：修正有害基因突變；增加基因產(chǎn)物多樣性；與組織發(fā)育與分化的有關(guān)的調(diào)控方式

27整理ppt五RNA再編碼（RNArecoding)RNA再編碼：對RNA編碼序列閱讀方式的改變主要方式：利用校正tRNA。（校正tRNA：是變異的tRNA，反密碼子環(huán)堿基發(fā)生改變，或是決定tRNA特異性即個性的堿基發(fā)生改變，從而改變了譯碼規(guī)則，使錯誤的編碼信息受到校正。消除錯義、無義和移碼突變的影響。）

①改變反密碼子或決定tRNA特異性的堿基②閱讀二聯(lián)體或四聯(lián)體密碼子方式，修正移碼突變28整理ppt第三節(jié)RNA指導下的

RNA和DNA的合成一RNA復制(RNAreplication)：主要存在于RNA病毒中以RNA為模板，合成互補RNA的過程。條件：RNA復制酶催化（RDRP，專一性極高）需要RNA模板、4種核糖三核苷酸和Mg2+復制進行的方向5’3’。

29整理ppt1.噬菌體QRNA的復制：噬菌體QRNA：4500Nt,可編碼3-4個蛋白。基因有重疊。外殼蛋白在轉(zhuǎn)錄時發(fā)生通讀，則產(chǎn)生A1蛋白。噬菌體QRNA本身(+鏈)是mRNA，可以直接翻譯。只有一個起始密碼是開放的復制酶亞基合成后，利用宿主的成分裝配復制酶。30整理ppt2噬菌體Q復制酶組成：噬菌體Q復制酶專一性極高，只作用于自身RNA，對宿主RNA及其它RNA無反應(yīng)。并且強烈抑制核糖體與RNA結(jié)合。31整理ppt首先酶吸附在QRNA3’端，以Q正鏈為模板合成負鏈；再以負鏈為模板合成大量正鏈，并合成成熟所需要的蛋白。需要HFI和HFII速度35Nt/s不需HFI和HFII32整理pptQ噬菌體復制特點：（1）盡可能利用宿主成分，簡化自身基因組。（2）各種蛋白成分效率高，兼具多種功能：

Q復制酶:復制專一性極高；蛋白合成阻遏物外殼蛋白：結(jié)構(gòu)蛋白；復制酶合成的調(diào)節(jié)蛋白（3）基因表達采用時序調(diào)控方式33整理ppt3病毒RNA復制的主要方式：（1）含正鏈RNA的病毒：噬菌體Q、灰質(zhì)炎病毒先合成復制酶及相關(guān)蛋白

RNA復制蛋白合成裝配（2）含負鏈RNA及復制酶的病毒：狂犬病病毒利用自身攜帶的復制酶合成正鏈RNA合成病毒蛋白（3）含雙鏈及復制酶的病毒：呼腸孤病毒以雙鏈為模版不對稱轉(zhuǎn)錄出正鏈RNA合成病毒蛋白RNA復制（4）致癌RNA病毒：一般含有兩條相同正鏈RNA（二倍體）先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄合成DNAmRNA蛋白34整理ppt二RNA逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）逆（反）轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板合成DNA1逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)：依賴RNA的DNA聚合酶(RNA-dependentDNApolymerase,RDDP)、RNA指導的DNA聚合酶(RNA-directedDNApolymerase)

1970年TeminH.等發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶，證實前病毒學說。1975年，獲得諾貝爾醫(yī)學/生理學獎35整理ppt2逆轉(zhuǎn)錄酶的性質(zhì)：需引物（tRNA)、模板和Mg2+等二價陽離子。按照5’3’合成是多功能酶：（1）具有RNA指導的DNA聚合酶活力（RDDP)（2）具有DNA指導的DNA聚合酶活力(DDDP)（3）具有核糖核酸酶H(RNaseH，核酸外切酶)活性(專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA)以mRNA為模板(具有polyA尾巴，可以polydT為引物)合成的互補DNA——cDNA36整理pptDDDP5

cDNA的

合成37整理ppt3逆轉(zhuǎn)錄的基本過程：

以RNA為模板（無翻譯功能）→RNA-DNA雜交體→RNaseH水解去除RNA→以cDNA為模板復制DNA雙鏈→利用自身長末端重復序列（longterminalrepeat,LTR）整合到宿主DNA→前病毒（provirus）→轉(zhuǎn)錄→翻譯

38整理ppt3兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒（逆病毒）：（1）逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒：HIV、致癌病毒以RNA為基因攜帶者：兩條+鏈，5’端以氫鍵結(jié)合，有5’帽子、3’-polyA尾巴，5’端附近帶有一個宿主tRNA引物生活周期：RNA（+）逆轉(zhuǎn)錄DNA(-)RNA(+)蛋白負鏈DNA合成的引物：tRNA（2）乙型肝炎病毒（HBV）：以DNA為基因攜帶者（帶缺口的雙鏈環(huán)狀DNA）生活周期：DNA()

轉(zhuǎn)錄RNA（+）逆轉(zhuǎn)錄DNA(-)DNA()

負鏈DNA合成的引物：蛋白兩種病毒顆粒都攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶39整理ppt三逆轉(zhuǎn)座子（retroposon)

逆轉(zhuǎn)座子：轉(zhuǎn)座需要以RNA為中間體，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄再分散到基因組中的可移動因子