基因診療專業(yè)知識(shí)講座基因診斷—利用分子生物學(xué)技術(shù)，從 DNA/RNA水平檢測(cè)基因的存在,分析基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，從而對(duì)疾病作出診斷。一、基本概念2基因診療專業(yè)知識(shí)講座二、基因診斷常用方法㈠ 核酸分子雜交㈡ PCR㈢ DNA序列測(cè)定㈣ DNA芯片技術(shù)3基因診療專業(yè)知識(shí)講座(一) 核酸雜交基本原理-------核酸變性和復(fù)性理論

即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開(kāi)，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。因此應(yīng)用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，就可檢測(cè)樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核苷酸序列。4基因診療專業(yè)知識(shí)講座probeprobe5基因診療專業(yè)知識(shí)講座核酸雜交的關(guān)鍵要素probeDNAtargetDNAsignaldetection6基因診療專業(yè)知識(shí)講座核酸雜交方法分類按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。7基因診療專業(yè)知識(shí)講座固相雜交分類Southern印記雜交Northern印記雜交斑點(diǎn)雜交原位雜交8基因診療專業(yè)知識(shí)講座Southernblot是最經(jīng)典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進(jìn)行定量和測(cè)定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。9基因診療專業(yè)知識(shí)講座Northern雜交用于RNA的檢測(cè)，能對(duì)組織細(xì)胞中總RNA或mRNA進(jìn)行定性和定量分析。10基因診療專業(yè)知識(shí)講座斑點(diǎn)雜交（Dotblot）可用基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量分析，方法簡(jiǎn)單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽(yáng)性。11基因診療專業(yè)知識(shí)講座原位雜交

（Colonyinsituhybridization）可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷；原位雜交的結(jié)果是顯示有關(guān)核酸序列的空間位置情況，因此可檢出含核酸序列的具體細(xì)胞，細(xì)胞的具體定位，數(shù)目和類型，可檢出基因和基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。12基因診療專業(yè)知識(shí)講座（二）利用PCR及結(jié)合其他技術(shù)進(jìn)行基因診斷直接采用PCR進(jìn)行基因診斷采用PCR產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLPs）進(jìn)行基因診斷采用PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）斑點(diǎn)雜交進(jìn)行基因診斷*通過(guò)PCR產(chǎn)物的反相點(diǎn)雜交(RBD)進(jìn)行基因診斷采用PCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析進(jìn)行基因診斷采用PCR技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行定量分析13基因診療專業(yè)知識(shí)講座寡核苷酸雜交分析SNP和等位基因特異寡核苷酸雜交（ASO）#14基因診療專業(yè)知識(shí)講座（三）DNA序列測(cè)定

DNA序列測(cè)定是進(jìn)行基因突變檢測(cè)的最直接、最準(zhǔn)確的方法，可以確定突變的部位，突變的性質(zhì)。15基因診療專業(yè)知識(shí)講座（四）DNA芯片技術(shù)

應(yīng)用DNA芯片，可以檢測(cè)基因的結(jié)構(gòu)及其突變多態(tài)性，對(duì)基因表達(dá)的情況進(jìn)行分析。16基因診療專業(yè)知識(shí)講座二基因診斷的特點(diǎn)高特異性高靈敏度獲得穩(wěn)定的結(jié)果早期快速適用性強(qiáng)，應(yīng)用范圍廣17基因診療專業(yè)知識(shí)講座第二節(jié)遺傳病的基因診斷18基因診療專業(yè)知識(shí)講座一、概述人類的遺傳病達(dá)數(shù)千種地中海貧血在意大利等國(guó)家發(fā)病率達(dá)10％鐮狀細(xì)胞貧血在美國(guó)黑人中發(fā)病率達(dá)14％我國(guó)常見(jiàn)的遺傳性疾病有地中海貧血、異常血紅蛋白病和血友病。有效治療難；通過(guò)基因診斷進(jìn)行攜帶者篩查，產(chǎn)前早期診斷，降低發(fā)病率。19基因診療專業(yè)知識(shí)講座二、鐮狀細(xì)胞貧血血紅蛋白?。ó惓Ｑt蛋白病）紅細(xì)胞呈鐮刀狀，壽命短，引起溶血性貧血?；颊叨嘣诔赡暌郧八劳?0基因診療專業(yè)知識(shí)講座×MstⅡ酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb（一）鐮狀紅細(xì)胞貧血分子機(jī)制5 6 7--Pro Glu Glu—--CCT

GAG

GAG--5 6 7--Pro Ala Glu—--CCT

GTG

GAG--21基因診療專業(yè)知識(shí)講座（二）鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷方法限制性內(nèi)切酶/Southernblot 采集制備血液DNA→內(nèi)切酶MstⅡ消化→電泳→轉(zhuǎn)膜→32P標(biāo)記的β珠蛋白cDNA雜交→放射自顯影22基因診療專業(yè)知識(shí)講座+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析23基因診療專業(yè)知識(shí)講座PCR/限制性內(nèi)切酶設(shè)計(jì)引物→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切→電泳→EB染色→直接觀察例：引物1：5’-GGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’引物2：5’-AATAGACCAATAGGCAGAG-3’ 擴(kuò)增產(chǎn)物294bp鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷方法24基因診療專業(yè)知識(shí)講座引物1CCT

GAG

GAGCCT

GTG

GAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMstⅡ酶切位點(diǎn)(CCTNAGG)25基因診療專業(yè)知識(shí)講座+﹣103bp191bp294bp正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者PCR產(chǎn)物的限制性酶切分析26基因診療專業(yè)知識(shí)講座RT-PCR/序列分析

采集制備血液RNA→RT-PCR→產(chǎn)物測(cè)序→推測(cè)氨基酸序列→進(jìn)行診斷鐮狀細(xì)胞貧血的基因診斷方法27基因診療專業(yè)知識(shí)講座二、β－地中海貧血

(β－Thalassaemia,簡(jiǎn)寫βthal或βT)β珠蛋白基因突變導(dǎo)致該多肽鏈的合成大為減少（β＋）或完全缺失（β0）β珠蛋白合成速率降低，導(dǎo)致β鏈和α鏈合成的不平衡→多余的珠蛋白鏈沉積在紅細(xì)胞膜上→改變了膜的通透性和硬度→導(dǎo)致溶血性貧血。高危人群地中海人、中東人、印度人、中國(guó)人；中國(guó)人群中又一廣東、廣西、四川、貴州等省發(fā)病率最高。缺乏有效治療措施。28基因診療專業(yè)知識(shí)講座（一）β地貧病的分子基礎(chǔ)β珠蛋白基因全長(zhǎng)2053bp，含2個(gè)內(nèi)含子（IVS－I和IVS-II），3個(gè)外顯子。目前發(fā)現(xiàn)突變有百余種，中國(guó)人群發(fā)現(xiàn)約20種；一般對(duì)特定種族來(lái)說(shuō)，90%的β地貧基因僅由4～6種突變組成。29基因診療專業(yè)知識(shí)講座（二）β地中海貧血的基因診斷PCR/ASO斑點(diǎn)雜交法 合成2對(duì)PCR引物（擴(kuò)增區(qū)段700bp和580bp，分別包含14種和1種可能突變）→合成等位特異寡核苷酸(ASO)探針（4～6對(duì)，分別標(biāo)記） →制備DNA樣品 →PCR擴(kuò)增 →斑點(diǎn)印跡雜交RFLP分析法30基因診療專業(yè)知識(shí)講座三α地中海貧血的基因診斷ac左側(cè)缺失4.2kb右側(cè)缺失3.7kbbbbaα2α1α1α2N端α1C端正?；蛐蛄蠵CR擴(kuò)增法——定性分析左側(cè)缺失型基因序列右側(cè)缺失型基因序列ac擴(kuò)增0.4kbab無(wú)擴(kuò)增片段ab擴(kuò)增1.2kb31基因診療專業(yè)知識(shí)講座+﹣0.4kb1.2kb正常人右側(cè)缺失患者地中海貧血患者基因組的PCR分析左側(cè)缺失患者32基因診療專業(yè)知識(shí)講座四、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）

1.DMD是常見(jiàn)的性連鎖隱性遺傳病，2.主要特征是進(jìn)行性肌萎縮和腸肌假性肥大，XP21.21—21.3區(qū)抗肌萎縮蛋白基因突變形式不同。DMD多在5歲發(fā)病，10歲左右癱瘓，在20歲左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其發(fā)病率為活產(chǎn)男嬰的1/3500。

33基因診療專業(yè)知識(shí)講座（一）DMD分子基礎(chǔ)：抗肌萎縮蛋白基因長(zhǎng)約2900kb，含79個(gè)外顯子?？辜∥s蛋白基因突變分為基因缺失型和非基因缺失型。（1）DNA片段缺失（60%的病例→導(dǎo)致閱讀框移碼→移碼實(shí)變→致DMD，整碼缺失→BMD）。缺失的2個(gè)熱點(diǎn)區(qū)①該基因5’端處②45~55外顯子范圍內(nèi)。（2）非基因缺失型部分重復(fù)（病例的5%）34基因診療專業(yè)知識(shí)講座（1）基因組探針?lè)?用XP21區(qū)分離得到的不同探針如（P20）來(lái)進(jìn)行相應(yīng)內(nèi)切酶酶譜分析、檢出率取決于探針數(shù)和酶切位點(diǎn)數(shù)目。（2）cDNA探針?lè)?抗肌萎縮蛋白基因系列cDNA探針?lè)治龌颊呋蛉笔А⑼怙@子拼接改變和基因內(nèi)部分重復(fù)。（3）多重PCR法 如有人設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增該基因的9個(gè)易發(fā)缺失“熱點(diǎn)區(qū)”DNA片段，可檢出80%有基因缺失的DMD患者。（4）多態(tài)性分析法 基因內(nèi)及其旁側(cè)探針進(jìn)行RFLP連鎖分析。（5）RT—PCR擴(kuò)增該基因外顯子（全長(zhǎng)2.4MB、外顯子起來(lái)全長(zhǎng)c14kb、用多對(duì)引物）可檢出：外顯子拼接異常。聯(lián)用測(cè)序：可定位基因缺失的起始和終止。35基因診療專業(yè)知識(shí)講座1、苯丙酮尿癥是一種常見(jiàn)的隱性遺傳性氨基酸代謝病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→兒茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患兒出生后須及早得到低phe飲食治療，否則發(fā)生不可逆大腦損害和嚴(yán)重智力發(fā)育障礙。

苯丙氨酸羥化酶↓（肝）五、苯丙酮尿癥（PKU）36基因診療專業(yè)知識(shí)講座（一）PKU分子基礎(chǔ)（1）迄今約3/4的導(dǎo)致中國(guó)人PKU的突變基因已被查清，它們分屬11種PAH基因點(diǎn)突變。體外研究表明，這些突變導(dǎo)致PAH活力↓或喪失。（2）PAH第11外顯子的第399密碼GTA（val）→GTT（val）中性突變：①不改變?nèi)魏蜗拗泼缸R(shí)別位點(diǎn)，故又稱“序列多態(tài)性”。②這一“序列多態(tài)性”在PKU患者和正常人中存在著連鎖不平衡性，故可作為一種“遺傳標(biāo)記”應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。37基因診療專業(yè)知識(shí)講座①PCR/ASO探針?lè)ê蚉CR-RFLP連鎖分析法。②PCR/SSCP③直接測(cè)序法—若待診斷的PKU家系的基因突變類型尚屬“未知”或無(wú)RFLP信息。（二）PKU的DNA診斷38基因診療專業(yè)知識(shí)講座先合成ASO如： 正常探針： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突變探針： TCCATTAACAATAAGAATTT利用PCR/ASO探針?lè)ㄔ\斷苯丙酮尿癥39基因診療專業(yè)知識(shí)講座利用PCR/ASO探針?lè)ㄔ\斷苯丙酮尿癥▽◎△▲ ○◎△健康男性 ▽男性攜帶者

▲男性患者○健康女性 ◎女性攜帶者 ●女性患者●▽正常探針突變探針40基因診療專業(yè)知識(shí)講座第三節(jié)腫瘤的基因診斷41基因診療專業(yè)知識(shí)講座1 通過(guò)檢測(cè)腫瘤染色體易位及融合基因診斷腫瘤 慢粒：（染色體易位）費(fèi)城染色體 PCR檢測(cè)融合基因

2 檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因癌基因（ras）、抑癌基因（p53）、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3 檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒基因 HBVHCV－肝癌 EB－鼻咽癌4 檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物基因或mRNA

肝癌—甲胎蛋白（AFP）結(jié)腸癌—癌胚抗原（CEA）腫瘤基因診斷的策略42基因診療專業(yè)知識(shí)講座腫瘤標(biāo)記物基因的檢測(cè)著絲粒

染色體22bcrgenec-ablgene

染色體9

bcr-mRNA

bcr-abl

mRNA

染色體9,22

bcr-abl融合蛋白（具PTK活性）

慢性骨髓白血病

引物A引物B43基因診療專業(yè)知識(shí)講座2 癌基因和抑癌基因的檢測(cè)㈠ras癌基因的檢測(cè)ras基因中最常見(jiàn)的點(diǎn)突變是第12，13或61密碼子突變檢測(cè)方法：PCR/ASOPCR-SSCP44基因診療專業(yè)知識(shí)講座㈡p53的檢測(cè)p53基因突變主要為點(diǎn)突變，熱點(diǎn)區(qū)域位于密碼子130~290，以175、273、284最多見(jiàn)檢測(cè)方法：PCR—SSCPPCR—測(cè)序PCR—RFLP45基因診療專業(yè)知識(shí)講座㈢其它基因的檢測(cè)PCR結(jié)合其它技術(shù)基因芯片46基因診療專業(yè)知識(shí)講座4、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)或mRNA診斷腫瘤標(biāo)志物 是由腫瘤組織細(xì)胞產(chǎn)生的、與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)的物質(zhì)，包括腫瘤抗原、激素、酶、同工酶等?；驑?biāo)志和基因表型標(biāo)志（胚胎性抗原）檢測(cè)方法：PCR—ASOPCR—測(cè)序PCR—RFLPPCR－SSCP47基因診療專業(yè)知識(shí)講座第四節(jié)感染性疾病的

基因診斷48基因診療專業(yè)知識(shí)講座一、感染性疾病基因

診斷的策略針對(duì)病原體特異的核酸序列設(shè)計(jì)探針進(jìn)行雜交應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因保守序列核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用49基因診療專業(yè)知識(shí)講座特點(diǎn)簡(jiǎn)便、特異、快捷能檢測(cè)出潛在的病原體可對(duì)病原體進(jìn)行分類、分型鑒定不能得知病原體進(jìn)入體內(nèi)后機(jī)體的反應(yīng)50基因診療專業(yè)知識(shí)講座二、基因診斷的感染性疾?。ㄒ唬?、病毒特點(diǎn)：分離培養(yǎng)—周期長(zhǎng)，操作繁雜，制約因素多電鏡觀察—直觀快速，但昂貴免疫學(xué)診斷—簡(jiǎn)便快速，但存在問(wèn)題：不易檢出潛伏期的病毒有些病毒亞型多，抗原變異性大整合進(jìn)入人基因組的病毒51基因診療專業(yè)知識(shí)講座病毒核酸分析技術(shù)HBV—包含4個(gè)開(kāi)放閱讀框，S、C、P、X PCR PCR/限制性內(nèi)切酶譜分析 PCR/點(diǎn)雜交, PCR/Southernblot 基因芯片目的基因引物序列擴(kuò)增片段C5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’425bp5’AGTGCGAATCCACACTC3’52基因診療專業(yè)知識(shí)講座

調(diào)節(jié)和啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄LTRgagpolenv

tat，revLTR

長(zhǎng)末端重復(fù)序列調(diào)節(jié)蛋白基因正常的病毒基因產(chǎn)生病毒核心蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶

產(chǎn)生病毒外膜蛋白附加基因*HIV病毒基因組結(jié)構(gòu)53基因診療專業(yè)知識(shí)講座SARS——RT－PCR多重PCR熒光定量PCR55基因診療專業(yè)知識(shí)講座（二）、細(xì)菌細(xì)菌性痢疾——志賀菌，侵襲性大腸桿菌，大質(zhì)粒；PCR結(jié)核病——PCR

56基因診療專業(yè)知識(shí)講座（三）、寄生蟲重復(fù)序列探針?lè)?、寡核苷酸探針?lè)?、基因組探針?lè)?、PCR57基因診療專業(yè)知識(shí)講座第五節(jié)基因診斷策略58基因診療專業(yè)知識(shí)講座（一）檢測(cè)致病基因突變基因變異致病的類型：內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)的突變點(diǎn)突變、插入、缺失、重排、異位基因表達(dá)異常mRNA剪接異常外源基因的插入59基因診療專業(yè)知識(shí)講座