人牙周膜成纖維細胞對鹽酸林可霉素跨膜轉(zhuǎn)運的色譜情況,口腔科學論文牙周炎、冠周炎等牙科疾病嚴重危害人類健康,也給患者帶來極大痛苦[1].該類疾病的發(fā)作與厭氧菌感染相關(guān),抗生素的應用特別普遍.林可霉素屬于對多數(shù)厭氧菌、需氧菌有較強抗菌作用的廣譜抗菌藥,通過阻斷敏感菌核糖體的膿鏈延長來到達掏細菌細胞蛋白合成的作用.林可霉素早期被應用于骨髓炎、骨和關(guān)節(jié)感染、敗血癥等的臨床治療中,并獲得一定療效[2],其應用于牙周疾病的治療方面效果怎樣,當前報道尚少.本研究討論了人牙周膜成纖維細胞(HPDLF)對鹽酸林可霉素跨膜轉(zhuǎn)運的色譜情況,旨在為牙周局部和全身給藥提供實驗數(shù)據(jù).1材料與方式方法1.1試劑與設(shè)備高糖DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清由美國GIBCO公司提供,胰蛋白酶由美國Amresco公司提供,杭州四季青新生牛血清由浙江天杭生物科技有限公司提供,鹽酸林可霉素由美國Fluka公司提供.細胞培養(yǎng)皿由美國Coring公司提供,Agilent1100LC高效液相色譜儀由美國Technologies公司提供,圖像分析系統(tǒng)由德國萊卡公司提供,JY98超聲細胞粉碎機由寧波新芝生物科技股份有限公司提供.高效液相色譜法(HPLC)應用試劑為色譜純,其它細胞培養(yǎng)試劑為分析純.1.2HPDLF細胞培養(yǎng)在患者同意的情況下,取我院11~24歲年齡段行正畸治療時需鏟除的健康前磨牙,以無菌生理鹽水和培養(yǎng)基沖洗,取牙根中部1/3處進行牙周膜組織刮取,剪成碎屑并置入高糖CMEM培養(yǎng)基(含15%胎牛血清)貼壁培養(yǎng),培養(yǎng)條件:飽和濕度、5%二氧化碳、37℃,3h后翻瓶.傳代HPDLF細胞大量繁衍后,取6~10代用于本組實驗.MC3T3-E1細胞常規(guī)培養(yǎng),飽和濕度、5%二氧化碳、37℃培養(yǎng)條件下于高糖DMEM培養(yǎng)基(含10%新生牛血清)培養(yǎng)[3~4].1.3樣品制備傳代HPDLF細胞1mL接種于12孔板,密度5104/mL,常規(guī)條件下培養(yǎng)至細胞融合,行分組實驗.室溫(252℃)下以濃度0.01mol/LPBS行細胞快速沖洗,培養(yǎng)皿中參加鹽酸林可霉素藥液孵育,常規(guī)洗滌收集.超聲細胞粉碎機于冰浴條件下行細胞粉碎,超聲功率400W,循環(huán)操作30次,每次運行3s,各次間隔4s.裂解液高速離心后取上清液,應用孔徑0.22m的濾膜過濾處理,高效液相色譜儀下行色譜檢測[5].1.4色譜條件實驗溫度(252)℃,實驗濕度(6020)%.流動相應用孔徑0.45m濾膜于真空負壓條件下過濾后,超聲排氣.紫外檢測器,流速1ml/min,分析柱250mm4.6mm5m,柱溫30℃,進樣10L,波長214nm[6].1.5鹽酸林可霉素流動相濃度0.05mol/LPH值6.0的硼砂溶液、甲醇和乙腈混合液,配比比例分為5種:(1)75:20:5,(2)70:10:20,(3)60:20:20,(4)70:15:15,(5)70:17.5:12.5.對各配比的峰形、保存時間等參數(shù)進行比擬分析,最終選取配比為70:17.5:12.5的混合液進行相關(guān)研究.1.6蛋白濃度檢測細胞裂解液參加考馬斯亮藍染液充分混勻,于室溫下靜置10min,595nm紫外分光光度計測定吸光度,參照標準品濃度獲得標準曲線并計算蛋白濃度.各樣品均行3次檢測后,取平均值作為最終研究比擬數(shù)值.1.7統(tǒng)計學處理鹽酸林可霉素濃度與峰面積相關(guān)性應用線性回歸分析.PBS為空白對照組,不加藥細胞組樣本為陰性對照組,標準品為陽性對照組.各組樣本量超出3個.2結(jié)果2.1色譜學指標2.1.1峰值鹽酸林可霉素主成分峰保存時間為8.425min,主成分峰未遭到進樣峰影響,表示分離度良好.空白對照組、陰性對照組于鹽酸林可霉素保存時間附近無峰值.2.1.2線性關(guān)系以藥物濃度為X軸、以峰面積為Y軸進行直線回歸分析,獲得回歸方程Y=-1.1883+1.3163X,濃度范圍2g/ml-80g/ml,如此圖1所示,藥物濃度與峰面積的線性關(guān)系良好.2.1.3回收率分別對5g/mL、20g/mL和80g/mL濃度的標準品進行檢測,每種濃度均備足3份分別檢驗,并取平均值作為研究結(jié)果.如表1所示為鹽酸林可霉素回收率情況,平均回收率96.71%,平均相對標準偏差(RSD)2.99%.2.1.4重復性對1份樣品連續(xù)進行5次檢測,獲得平均相對標準偏差為2.69%.2.1.5精致細密度同日內(nèi)間隔性進行標準品溶液的屢次測定,日內(nèi)相對標準偏差為2.52%,日間相對標準偏差為3.82%.2.2胞內(nèi)藥物濃度進行鹽酸林可霉素HPDLF細胞和MC3T3-E1細胞培養(yǎng)經(jīng)過中,對濃度10g/ml樣品分別于1、5、10min時進行胞內(nèi)藥物濃度檢測,結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有藥物存在;對濃度20g/ml樣品分別于5、10min時進行胞內(nèi)藥物濃度檢測,仍未發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)有藥物存在.3討論牙周組織細胞在抗菌藥給藥環(huán)境下的跨膜轉(zhuǎn)運情況對于控制炎癥具有重要作用,該轉(zhuǎn)運經(jīng)過有利于對細胞內(nèi)感染各類細菌的抗菌治療.劉洪臣提出假講,以為根管以及牙周組織的通路給藥,可使藥物轉(zhuǎn)運至牙周局部組織乃至全身細胞組織[7].研究和討論相關(guān)抗菌藥的跨膜轉(zhuǎn)運情況對牙周局部和全身給藥的相關(guān)研究具有重要意義.Johnson等的研究以為林可霉素族藥物可在肺泡巨噬細胞中實現(xiàn)轉(zhuǎn)運[8],Klempner等研究氯林可霉素在中性粒細胞中可實現(xiàn)轉(zhuǎn)運[9],Hand等報道氯林可霉素可在單核細胞中轉(zhuǎn)運[10].但本組研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)鹽酸林可霉素在HPDLF中存在轉(zhuǎn)運,與相關(guān)報道有所差異,可能由于藥物構(gòu)造、檢驗方式方法學、細胞類型等有關(guān).藥物構(gòu)造方面,盡管有研究指出林可霉素類抗菌藥在某些細胞中存在跨膜轉(zhuǎn)運,但當前鮮見對鹽酸林可霉素的詳細研究,可能遭到鹽酸林可霉素與其它林可霉素類用藥間的結(jié)核性差異影響;方式方法學方面,固然波長檢測具有較好的抗菌藥物含量檢測效果,但其貼近于紫外檢測器下限,易造成流動相中乙腈等有機物的末端吸收,產(chǎn)生較大噪音,這可能是影響檢測靈敏度的因素之一;細胞類型方面,國內(nèi)有研究檢測羅紅霉素、甲硝唑、替硝唑的HPDLF跨膜轉(zhuǎn)運情況,但無鹽酸林可霉素對HPDLF轉(zhuǎn)運的研究.當前抗菌藥在細胞間的轉(zhuǎn)運基質(zhì)尚不明確,因此暫時無法明確HPDLF中抗菌藥無轉(zhuǎn)運的詳細原因.當然,劉洪臣的報道僅為假講,可以能確實存在HPDLF和MC3T3-E1細胞無鹽酸林可霉素跨膜轉(zhuǎn)運的情況,能否能夠通過根管及牙周組織的通路給藥使藥物轉(zhuǎn)運至牙周局部組織和全身以到達抗菌抗炎作用,仍需進一步研究分析討論.以下為參考文獻1劉貴臣.牙周炎患者正畸治療經(jīng)過中齦溝液及血清中多項白介素、PGE2、SICAM-1及PAK5水平的變化研究[J].中國醫(yī)藥導刊,2020;14(6):989~9902江漫,趙紅.我院2009年抗感染藥物不良反響報告分析[J].中國醫(yī)藥導刊,2018;12(8):1397~13983劉宇,劉洪臣,吳霞,等.人牙周膜成纖維細胞對甲硝唑替硝唑的跨膜轉(zhuǎn)運[J].口腔頜面修復學雜志,2007;8(2):90~93,964余立強,劉洪臣,吳霞,等.人牙周膜成纖維細胞對甲硝唑攝取機制的研究[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志,2018;7(2):71~755劉宇,劉洪臣,吳霞,等.人牙周膜成纖維細胞對羅紅霉素的跨膜轉(zhuǎn)運[J].北京口腔醫(yī)學,2008;16(3):138~1416邵蓓新,張穎,李建軍,等.毛細管電泳-電致化學發(fā)光法測定鹽酸林可霉素[J].鄭州大學學報(工學版),2018;32(4):99~1027劉洪臣.牙根管全身給藥假講[J].中華老年口腔醫(yī)學雜志,2007;5(1):2~38高云,鐘良軍,張源明,等.慢性牙周炎合并動脈粥樣硬化兔動物模型的抗炎干涉研究