/wswxtbcnJul.20,2023,50(7):3020?3Copyright?2023MicrobiologyChinaAllRightsReserved研究報(bào)告研究報(bào)告吳杰2，羅燕*11四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川成都611130李依李依濛,劉潔,焦升鏡,伍茜,丁慧,付文龍,周磊,程建國,吳杰,羅燕.林麝源銅綠假單胞菌噬菌體vB_PaeM_PAMD02的生物學(xué)特性與全基因組序列分析[J].微生物學(xué)通報(bào),2023,50(7):3020-3034.LIYimeng,LIUJie,JIAOShengjing,WUXi,DINGHui,FUWenlong,ZHOULei,CHENGJianguo,WUJie,LUOYan.Biologicalcharacterization,andwholegenomesequencingofbacteriophageagainstPseudomonasaeruginosaisolatedfromforestmuskdeer(Moschusberezovskii)[J].MicrobiologyChina,2023,50(7):3020-3034.摘要：【背景】圈養(yǎng)林麝一半以上的死亡是由銅綠假單胞菌引起的化膿性疾病導(dǎo)致。另外，由于細(xì)菌的抗性增加，噬菌體是繼抗生素后的另一抗菌選擇。【目的】以分離自病死林麝肺臟的銅綠假單胞菌為宿主菌分離一株噬菌體，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性、全基因組序列分析與體內(nèi)抑菌試驗(yàn)。【方法】通過雙層平板法分離純化一株裂解性噬菌體，測定其裂解譜、最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線、熱穩(wěn)定性、最適生長pH等生物學(xué)特性，通過電鏡觀察其具體形態(tài)，進(jìn)行全基因組測序與序列分析，并進(jìn)行小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)。【結(jié)果】分離到一株裂解性銅綠假單胞菌噬菌體并命名為vB_PaeM_PAMD02，該噬菌體具有透明且邊緣清晰無暈環(huán)的噬菌斑，其裂解譜較窄，最佳感染復(fù)數(shù)為0.1，裂解潛伏期為40min，裂解暴發(fā)量較高，熱穩(wěn)定性較高，可耐受弱堿環(huán)境。其全基因組大小為66264bp，GC含量為55.59%，序列注釋結(jié)果顯示該噬菌體具有92個(gè)開放閱讀框，不含毒力與耐藥基因，屬于肌尾噬菌體科。小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示了PAMD02對(duì)其宿主菌良好的抑菌效果?！窘Y(jié)論】本研究分離的噬菌體PAMD02有較高的裂解效率，對(duì)不利環(huán)境有較好的耐受性，不含毒力基因與耐藥基因，具有應(yīng)用于臨床治療銅綠假單胞菌感染的潛力。關(guān)鍵詞：噬菌體；銅綠假單胞菌；生物學(xué)特性；全基因組序列分析；林麝資助項(xiàng)目：四川省科技廳省級(jí)科研院所科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2022JDZH0026)ThisworkwassupportedbytheScienceandTechnologyAchievementsTransferProjectfromScientificResearchInstitutionsofSichuanProvincialScienceandTechnologyDepartment(2022JDZH0026).*Correspondingauthor.E-mail:lycjg@163.comReceived:2022-10-08;Accepted:2023-01-03;Publishedonline:2023-02-22Biologicalcharacterization,andwholegenomesequencingofbacteriophageagainstPseudomonasaeruginosaisolaforestmuskdeer(MoschusberezovskLIYimeng1,LIUJie1,JIAOShengjing1,WUXi1,DINGHui1,FUWenlong2,ZHOULei2,CHENGJianguo2,WUJie2,LUOYan*11CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,Sichuan,China2SichuanInstituteofMuskDeerBreeding,Dujiangyan611830,Sichuan,ChinaAbstract:[Background]Pseudomonasaeruginosa(PA)isacommonopportunisticpathogen.ThesepticdiseasescausedbyPAaccountformorethan50%ofthedeathsincaptiveforestmuskdeerpopulations.Phageshavebecomepopularsubstitutesofantibioticsduetotheincreasedresistanceofbacteria.[Objective]ToisolateabacteriophageusingPAisolatedfromthelungsofdeadforestmuskdeerasthehostbacteria,andtoconductbiologicalcharacterization,wholegenomesequencing,andinvivobacteriostasistestonit.[Methods]Double-layeragarculturemethodwasusedtoisolatedaphageagainstPAfromthedailydrinkingwaterofforestmuskdeerinSichuanInstituteofMuskDeerBreeding.Thesamemethodwasusedtodeterminethehostrange,optimalmultiplicityofinfection(MOI),one-stepgrowth,thermostability,andpHrangeofthisphage.Phagemorphologywasobservedbytransmissionelectronmicroscopy(TEM).Thewholegenomeofthephagewassequencedandanalyzed,andinvivobacteriostasistestwascarriedoutinmice.[Results]AphagestrainagainstPAwasisolatedandnamedasvB_PaeM_PAMD02.Itproducedatransparentplaquewithclearedgeandnohaloringandhadanarrowhostrange.Thephagestrainhadhighthermostabilityandwasstableinweakbasicenvironment,withtheoptimalMOIof0.1andtheincubationperiodof40min.Thewholegenomesequencingshowedthatthegenomeofthisphagehadalengthof66264bpandtheGCcontentof55.59%.Theannotationresultsshowedthatthephagehad92openreadingframesandcarriednovirulencegeneorresistancegene.TheresultsindicatedthatthephagebelongedtotheMyoviridaefamily.Animalexperimentsshowedthatthephageeffectivelyinhibitedthepathogenicityofbacteriainmice.[Conclusion]TheisolatedphagevB_PaeM_PAMD02hashighlysisefficiencyandgoodtolerancetoadverseenvironments.IthasgreatpotentialtobeappliedinclinicalpreventionandtreatmentofPAinfection.Keywords:bacteriophage;Pseudomonasaeruginosa;biologicalcharacterization;wholegenome銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)是一種致病性革蘭氏陰性菌，屬假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomonas)，主要攻擊上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，常引起化膿性疾病，如心內(nèi)膜炎、胃腸炎、膿胸甚至敗血癥，某些情況還會(huì)導(dǎo)致免疫缺陷[1]。PA可通過感染動(dòng)物的糞便和分泌物污染農(nóng)業(yè)環(huán)境[2]。2016年P(guān)A的臨床分離率為8.66%[3]，2017年為8.69%[4]，TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn3022微生物學(xué)通報(bào)2018年P(guān)A的臨床分離率在所有分離菌株中位列第四，為9.57%[5]，呈逐年上升趨勢。2014–2019年，中國抗微生物耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)從血液樣本中分離出的前10種細(xì)菌中，PA是臨床上第七常見的病原體[6]。2021年，在中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)收集到的臨床分離株中，不發(fā)酵糖革蘭氏陰性桿菌數(shù)占總數(shù)的五分之一，其中銅綠假單胞菌的分離率為34.9%，占據(jù)第一[7]。同時(shí)，由于PA對(duì)于碳青霉烯類抗生素的敏感性越來越低，臨床上對(duì)于銅綠假單胞菌的治療用藥也越來越艱難。林麝(Moschusberezovskii)是我國的一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，隸屬于偶蹄目麝科(Moschidoe)麝屬(Moschus)[8]，于2003年被指定為保護(hù)動(dòng)物[9]，并在《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》中被列為瀕?；蛞孜?dòng)物[10]。由于人為及環(huán)境因素，野生麝類資源瀕臨枯竭，人工養(yǎng)殖是保護(hù)瀕危林麝較為有效的方式。林麝化膿性疾病是制約人工大規(guī)模養(yǎng)殖林麝的重要因素之一[11]，是我國圈養(yǎng)麝群中發(fā)病率最高和危害最嚴(yán)重的群發(fā)性疾病之一。引起該種疾病的病原菌種類繁多，如銅綠假單胞菌[12]、化膿隱秘桿菌[13]、大腸桿菌[11]、沙門氏菌[14]、葡萄球菌[15]等。從多年流行情況看，患化膿性疾病的林麝在所有病麝中占50%以上[16]。噬菌體(bacteriophage,phage)于20世紀(jì)初被發(fā)現(xiàn)并命名[17]，它們可以在細(xì)菌體內(nèi)繁殖并殺死細(xì)菌細(xì)胞，可以分為裂解性噬菌體和溶原性噬菌體[18]。其中，裂解性噬菌體被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌感染治療，即噬菌體治療[19]。目前利用噬菌體治療皮膚軟組織感染和呼吸道感染已經(jīng)在不同的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的研究和測試[20-21]，噬菌體相關(guān)基因工程改造酶也表現(xiàn)出了對(duì)于其宿主菌高效的控制效果[22]。相較于傳統(tǒng)的抗生素藥物，噬菌體對(duì)于機(jī)體幾乎無毒副作用[23-25]。因其高效和特異的抗菌性，噬菌體治療相關(guān)研究已在國內(nèi)外引起廣泛的關(guān)注[26]。本研究以分離自病死林麝肺臟的銅綠假單胞菌為宿主菌，從四川養(yǎng)麝研究所圈養(yǎng)林麝的日常飲水中分離到一株裂解性噬菌體vB_PaeM_PAMD02，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性和全基因組序列分析，并進(jìn)行小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)，以期為后續(xù)利用噬菌體防治細(xì)菌性疾病的研究提供理論基礎(chǔ)。1.1菌株、水樣和試驗(yàn)動(dòng)物本研究所使用細(xì)菌均為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室分離并保存。所用銅綠假單胞菌分離于病死林麝肺臟[27]，基因型為ST1249，為該麝場流行菌株。水樣收集自四川養(yǎng)麝研究所圈養(yǎng)林麝的日常飲水。試驗(yàn)所用小鼠為六周齡SPF級(jí)昆明小鼠，雌性12只，雄性12只，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。根據(jù)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用的所有機(jī)構(gòu)和國家指南，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)科技管理處動(dòng)物福利委員會(huì)批準(zhǔn)了動(dòng)物試驗(yàn)(批準(zhǔn)編號(hào)為20220263)。1.2主要試劑和儀器DNaseI、RNaseA、綠豆酶、6×loadingbuffer、TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit，寶生物(大連)有限公司；1mol/LTris-HCl(pH7.4)、DL2000DNAMarker，北京索萊寶科技有限公司；0.22μm與0.45μm一次性針頭式過濾器，Millipore公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購自萬科化學(xué)試劑公司。SMbuffer：NaCl5.8g，MgSO4·7H2O2.0g，1mol/LTris-HCl(pH7.4)50mL，2%明膠5mL，加蒸餾水至1000mL，1×105Pa高壓滅菌20min，4℃冰箱保存。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn核酸電泳儀(NanoDropND-2000)、QuantityOne凝膠成像儀，Bio-Rad公司；水平電泳槽、電泳儀，北京六一儀器廠；冷凍型18孔離心機(jī)，艾本德有限公司；透射電子顯微鏡，成都里來生物科技有限公司。1.3噬菌體分離與純化使用雙層平板法分離及純化噬菌體[28]。將水樣在12000r/min離心10min，吸取上清過濾處理后，與菌液按體積比1:1混合放置30min，加入到3mL60℃預(yù)熱融化的LB半固體培養(yǎng)基(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0.6%)中混勻，倒入LB固體培養(yǎng)基(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為1.2%)平板內(nèi)鋪平，待其凝固后放置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，以獲得單獨(dú)的噬菌斑。挑取單個(gè)噬斑置于1mLSMBuffer中，37℃、180r/min振蕩過夜。10倍梯度稀釋后，使用雙層平板法獲得單獨(dú)噬斑。此步驟重復(fù)3次保證獲得純化的噬菌體。選擇噬菌斑數(shù)目在30?300之間的平板計(jì)算噬菌體效價(jià)。噬菌體效價(jià)計(jì)算公式為：效價(jià)(PFU/mL)=噬菌斑數(shù)目×稀釋倍數(shù)×10。1.4噬菌體形態(tài)觀察將純化后的噬菌體原液滴在覆有碳膜的銅網(wǎng)上，靜置15min，用濾紙吸干銅網(wǎng)上多余的液體，滴加2%磷鎢酸(pH7.0)染色10min，靜置使其干燥。使用透射電子顯微鏡觀察噬菌體形態(tài)。1.5噬菌體裂解譜測定測試菌為肺炎克雷伯氏菌3株、大腸桿菌2株、金黃色葡萄球菌2株，志賀氏菌2株，以及創(chuàng)口博德特式菌、波氏桿菌、沙門氏菌各一株。采用點(diǎn)樣法[29]，取300μL測試菌液，與LB半固體培養(yǎng)基混合，鋪在LB固體培養(yǎng)基上。將噬菌體均勻滴于平板上，每次5μL，37℃培養(yǎng)8h，觀察平板上是否出現(xiàn)噬菌斑。如果有噬菌斑，則細(xì)菌可以被該噬菌體裂解。1.6噬菌體生物學(xué)特性測定1.6.1最佳感染復(fù)數(shù)測定取噬菌體與菌液按噬菌體數(shù)量/細(xì)菌數(shù)量=10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001混合。于37℃培養(yǎng)6h。雙層平板法計(jì)算各組噬菌斑數(shù)目。產(chǎn)生噬斑數(shù)目最多的比例即為最佳感染復(fù)數(shù)。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。1.6.2一步生長曲線測定按最佳感染復(fù)數(shù)的比例混合噬菌體與菌液，在恒溫水浴培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。每隔20min取100μL培養(yǎng)物。10倍梯度稀釋后，使用雙層平板法測定其效價(jià)，重復(fù)3次。以噬菌體效價(jià)(PFU/mL)為縱坐標(biāo)、時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)繪制一步生長曲線，得到噬菌體的潛伏期、裂解期和穩(wěn)定期，并計(jì)算裂解量。裂解量計(jì)算公式[30]為：裂解量(PFU/cell)=裂解末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度。1.6.3熱穩(wěn)定性、最適生長pH值與氯仿敏感性檢測將噬菌體在37、50、60、70、80℃分別靜置20、40、60min。將噬菌體與pH5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的SM緩沖液混合分別靜置5、10、15min。取噬菌體與氯仿置于無菌離心管中混合，劇烈振蕩2min，37℃處理1h后，收集含有噬菌體的上層液體。使用雙層平板法測定以上試驗(yàn)中的噬菌體效價(jià)，計(jì)算各組噬菌斑數(shù)目。以上試驗(yàn)重復(fù)3次。其中氯仿敏感性試驗(yàn)需同時(shí)進(jìn)行正常的噬菌體噬菌斑試驗(yàn)對(duì)比觀察。1.7噬菌體全基因組測序與序列分析1.7.1噬菌體基因類型測定使用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit提取噬菌體核酸，將提取物分為DNaseI組、RNaseA組、綠豆酶組和對(duì)照組。加入適量的DNaseI、RNaseA和綠豆酶，分別TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn3024微生物學(xué)通報(bào)在37°C處理60、60、10min。使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行可視化和分析。1.7.2噬菌體全基因組測序全基因組測序在IlluminaNovaSeq二代測序平臺(tái)上進(jìn)行雙末端(paired-end,PE)測序，構(gòu)建文庫類型為PE400。使用ABySS2.0[31]和MIRA4.0[32]拼接噬菌體基因組序列。使用GeneMark[33](/GeneMark)預(yù)測基因組蛋白編碼基因，對(duì)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行分析，并與Rfam數(shù)據(jù)庫[34](/)進(jìn)行比較，得到非編碼RNA的預(yù)測結(jié)果。使用BLAST在線工具(/Blast.cgi)驗(yàn)證序列的相似性。將基因組序列和基因預(yù)測信息整合成標(biāo)準(zhǔn)的GenBank格式文件，使用CGView(http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/)繪制噬菌體基因組圖譜。運(yùn)用MEGA7.0和neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.8小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)將24只小鼠分為4組，分別為對(duì)照組(controlgroup)、噬菌體組(phagegroup)、攻毒組(challengegroup)和抑菌組(antibacterialgroup)，每組3只雄性和3只雌性。各組在經(jīng)水合氯醛注射麻醉后進(jìn)行滴鼻，其中對(duì)照組、噬菌體組和攻毒組分別在滴注SM緩沖液、噬菌體液、菌液4h后滴注磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)，抑菌組在滴注菌液后4h滴注噬菌體，具體方案如表1所示。根據(jù)最佳感染復(fù)數(shù)，細(xì)菌使用濃度為108CFU/mL，噬菌體使用濃度為107PFU/mL。于48h后，用10%水合氯醛麻醉所有小鼠并解剖。取出小鼠肺臟觀察病理變化后，進(jìn)行肺臟菌落計(jì)數(shù)。同時(shí)，取不超過2.0cm×2.0cm×0.5cm的明顯病灶區(qū)域，表1小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)滴鼻方案Table1Nasaldropsforeachgroupofmice組別SM緩沖液噬菌體銅綠假GroupsSMbuffer(μL)Phage(μL)單胞菌(μL)Controlgroup––Phagegroup Challengegroup Antibacterialgroup –：不進(jìn)行滴鼻–:Withoutinjection.浸泡在4%甲醛固定液中，送成都里來生物公司進(jìn)行病理切片分析。2結(jié)果與分析2.1銅綠假單胞菌噬菌體的分離與純化在本試驗(yàn)中，分離到一株裂解性的銅綠假單胞菌噬菌體，并命名為vB_PaeM_PAMD02。其噬菌斑邊緣清晰、光滑、無暈環(huán)(圖1A)。原始噬菌體效價(jià)為1.59×109PFU/mL。透射電鏡顯示，PAMD02衣殼直徑約為70nm，尾部結(jié)構(gòu)長約140nm(圖1B)，具有典型的有尾噬菌體目肌尾噬菌體科的特征。2.2噬菌體vB_PaeM_PAMD02裂解譜試驗(yàn)重復(fù)3次后，除宿主菌外，其他受試細(xì)菌平板上均未出現(xiàn)明顯清晰的噬菌斑(表2)。PAMD02無法裂解其他被測試的細(xì)菌，其裂解譜較窄。2.3噬菌體的生物學(xué)特性2.3.1最佳感染復(fù)數(shù)與一步生長曲線根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，PAMD02在MOI=0.1時(shí)獲得最高滴度，因此噬菌體PAMD02的最佳感染復(fù)數(shù)為0.1。具體結(jié)果見表3。根據(jù)一步生長曲線(圖2)，PAMD02的潛伏期為0–40min，裂解期為40–80min，裂解量為65.8PFU/cell。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn圖1噬菌體vB_PaeM_PAMD02的形態(tài)A：噬菌體在雙層瓊脂平板上的噬菌斑形態(tài).B：噬菌體透射電鏡圖Figure1MorphologyofthephagevB_PaeM_PAMD02.A:Plaquesofthephage.B:Transmissionelectronmicrographofthephage.表2噬菌體vB_PaeM_PAMD02的裂解譜Table2HostrangeofvB_PaeM_PAMD02NoBacteria來源Source噬菌體vBPaeMPAMD02PseudomonasaeruginosaForestmuskdeer+KP1KlebsiellapneumoniaeForestmuskdeer–KP2KlebsiellapneumoniaeCattle–KP3KlebsiellapneumoniaePig–E.coli1EscherichiacoliForestmuskdeer–E.coli2EscherichiacoliCattle–StaphylococcusaureusForestmuskdeer–StaphylococcusaureusCattle–BbBordetellabronchisepticaForestmuskdeer–BoBordetellatrematumForestmuskdeer–SalmonellaForestmuskdeer–ShigellacastellaniPig–ShigellacastellaniPig–+:Lysis;–:Nolysis.2.3.2熱穩(wěn)定性、最適生長pH值與氯仿敏感性試驗(yàn)中，PAMD02在50℃處理后的活性明顯高于37℃處理后的活性；但在60℃和70℃對(duì)50–70℃有很高的耐受性(圖3A)，同時(shí)其明顯更能耐受弱堿性環(huán)境(圖3B)。然而經(jīng)氯仿處理后噬菌體PAMD02的效價(jià)并未發(fā)生明顯變化，說明其對(duì)氯仿不敏感。TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn3026微生物學(xué)通報(bào)表3噬菌體vB_PaeM_PAMD02的最佳感染復(fù)數(shù)測定Table3DeterminationofMOIofp感染復(fù)數(shù)噬菌體銅綠假單胞菌噬菌體效價(jià)MOIPhage(PFU/mL)PA(CFU/mL)Phagetiter(PFU/mL)0.01684.55×1090.10783.62×101088988.73×109983.83×109972.06×109圖2噬菌體vB_PaeM_PAMD02一步生長曲線Figure2One-stepgrowncurveofphagevB_PaeM_PAMD02.2.4全基因組測序與分析結(jié)果2.4.1基因組測序分析結(jié)果根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，PAMD02經(jīng)DNaseⅠ處理的樣品泳道無條帶，經(jīng)RNaseA和綠豆酶處理的樣品泳道有清晰條帶，大小與噬菌體基因組大小相同。因此噬菌體vB_PaeM_PAMD02是線性雙鏈DNA噬菌體[35]。具體結(jié)果如圖4所示。全基因組測序表明，vB_PaeM_PAMD02的完整基因組大小為66264bp(圖5)，GC含量為55.59%。上傳到NCBISRA庫后獲得的登錄號(hào)為SRP345538。BLASTn比較結(jié)果表明，噬菌體與PA噬菌體PHW2最相似(GenBank登錄號(hào)為MT349888.1)，具有98.00%的全基因組覆蓋率和98.63%的序列一致性。全基因組的注釋表正義鏈上，54個(gè)在反義鏈上，無tRNA。PAMD02蛋白的功能預(yù)測結(jié)果表明，有23種具有已知功能的蛋白質(zhì)基因被預(yù)測，包括13種結(jié)構(gòu)蛋白基因，其中有3種尾部相關(guān)蛋白基因，這些基因編碼的蛋白在噬菌體吸附到宿主菌表面的過程中起到重要作用；9種DNA復(fù)制及表達(dá)相關(guān)基圖3噬菌體vB_PaeM_PAMD02熱穩(wěn)定性及最適生長pHA：不同溫度下噬菌體的效價(jià)變化.B：不同pH下噬菌體的效價(jià)變化Figure3ResistanceofphagevB_PaeM_PAMD02totemperatureandpH.A:Phageactivityatdifferenttemperatures.B:PhageactivityatdifferentpHvalues.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn性對(duì)照組；C：DL2000DNAMarker；D：DNaseⅠFigure4ResultsofagarosegelelectrophoresisaftervB_PaeM_PAMD02digestion.A:vB_PaeM_PAMD02nucleicacidtreatedbyRNaseA;B:vB_PaeM_PAMD02nucleicacidthathasnotbeen因，位于基因組后半段，在噬菌體基因進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，這些基因表達(dá)的蛋白會(huì)參與噬菌體核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)等過程；1個(gè)裂解過程相關(guān)的內(nèi)溶素基因，與尾部蛋白相關(guān)基因位置相近，這是一種糖基水解蛋白，在噬菌體子代完成組裝后，從細(xì)胞內(nèi)部裂解宿主菌，使子代噬菌體釋放。在全基因組序列中未發(fā)現(xiàn)毒力或耐藥相關(guān)基因。2.4.2vB_PaeM_PAMD02的系統(tǒng)發(fā)育樹使用鄰近法，基于主要的衣殼蛋白和末端大亞基來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，vB_PaeM_PAMD02的主要衣殼蛋白與噬菌體SN和噬菌體LMA2的主要衣殼蛋白最緊密相關(guān)(圖6A)。此外，PAMD02的末端大亞基與噬菌體PASA16的末端大亞基最密切相關(guān)(圖6B)。以上3個(gè)噬菌體均屬于Myoviridea噬菌體家族的Pbunavirus。因此，vB_PaeM_PAMD02可能屬于Pbunavirus。圖5噬菌體vB_PaeM_PAMD02全基因組圖譜Figure5GenomiccirclemapofvB_PaeM_PAMD02.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn3028微生物學(xué)通報(bào)圖6使用噬菌體主要衣殼蛋白(A)和末端酶大亞基(B)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分支點(diǎn)上的數(shù)字代表可信噬菌體vB_PaeM_PAMD02Figure6Phylogeneticstreeswereformedbasedonmajorcapsidprotein(A)andterminaselargesubunit(B)ofthephage.Thenumberonthebranchpointrepresentsthecredibility,thecloserto100thebootstrapvalueis,thehigherconfidencelevelwouldbe;Scale:Thegeneticdistance,theshortertheruleris,theclosertherelationshipis;Redtriangle:PhagevB_PaeM_PAMD02.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn2.5小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果小鼠攻毒和治療試驗(yàn)過程中，每隔2h觀察小鼠精神狀況和死亡情況。24h內(nèi)僅攻毒組死亡3只小鼠，其在14h后又死亡1只，共死亡4只，其余組小鼠全部存活。在48h后解剖全部試驗(yàn)小鼠，觀察剖檢結(jié)果。各組均選取特征性病變明顯的肺臟組織，小鼠組織病理剖檢圖如圖7所示。滴鼻后觀察，空白對(duì)照組與噬菌體組小鼠精神不振，呼吸急促，采食量下降，后逐漸恢復(fù)正常，無死亡情況。剖檢后對(duì)照組小鼠肺臟組織有少量出血，無明顯病變。噬菌體組小鼠肺間質(zhì)輕度增厚，可見少量炎性細(xì)胞浸潤，主要為中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。攻毒組小鼠精神萎靡，行動(dòng)緩慢，抱團(tuán)瞇后又死亡1只，存活2只，存活小鼠呼吸急促并抱團(tuán)，剖檢后肺臟組織有明顯的病變，局部肺泡上皮細(xì)胞變性壞死，見壞死細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞質(zhì)溶解，胞核固縮或碎裂，肺泡間質(zhì)不同程圖7小鼠肺臟病理切片圖(400×)A：對(duì)照組小鼠肺臟病理切片.B：噬菌體組小鼠肺臟病理切片.C：攻毒組小鼠肺臟病理切片.D：抑菌組小鼠肺臟病理切片.出血(黃色箭頭)；炎癥細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)；肺間質(zhì)增厚(綠色箭頭)Figure7Themicrographsoflungandlivertissuesinfour-groupmice(400×).A:Lungsectionofcontrolgroupmice.B:Lungsectionofphagegroupmice.C:Lungsectionofchallengegroupmice.D:Lungsectionofantibacterialgroupmice.Bleedingorcongestion(yellowarrows);Inflammatorycells(bulearrows);Pulmonaryinterstitialthickening(greenarrows).TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn3030微生物學(xué)通報(bào)度增厚，可見不同程度炎性細(xì)胞浸潤，也可見巨噬細(xì)胞增多且肺血管內(nèi)充血，并且血管內(nèi)多量紅細(xì)胞聚集。抑菌組小鼠精神不振呼吸困難，在滴注噬菌體后24h內(nèi)臨床癥狀得到緩解，48h內(nèi)小鼠精神基本恢復(fù)正常，但精神狀況和行動(dòng)能力仍不及對(duì)照組小鼠，剖檢后肺臟組織肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)輕微出血，紅細(xì)胞溢出，肺間質(zhì)見部分纖維組織增生，其他未見明顯病理改變。小鼠肺臟細(xì)菌載量顯示(圖8)，在對(duì)照組與噬菌體組小鼠肺組織中均未分離到銅綠假單胞菌，而在攻毒組與抑菌組小鼠肺組織中均分離到銅綠假單胞菌，其中攻毒組的細(xì)菌載量為4.27×108CFU/mL，抑菌組肺部細(xì)菌載量為4.62×107CFU/mL，攻毒組細(xì)菌小鼠肺部載量明顯高于抑菌組。3討論與結(jié)論多重耐藥已成為阻礙治療細(xì)菌性感染的主要問題。2017年2月，世界衛(wèi)生組織公布了12種“超級(jí)細(xì)菌”的名單，其中銅綠假單胞菌是最重要的碳青霉烯類耐藥細(xì)菌之一。使用噬菌體是圖8肺部細(xì)菌載量比較Figure8Comparisonofpulmonarybacterialload.****:r<0.0001.克服病原體耐藥性的一種有潛力的方法，應(yīng)將其作為抗菌治療生物制劑予以重視[36]。與抗生素治療相比，噬菌體的優(yōu)勢尤為突出[25]，同時(shí)也有噬菌體和抗生素聯(lián)合使用的研究[37]。本研究分離到一株裂解性噬菌體vB_PaeM_PAMD02，其最佳感染復(fù)數(shù)為0.1，少量的噬菌體在短時(shí)間內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)大量增殖，產(chǎn)生大量子代。與PAMD02的遺傳序列最為相似的噬菌體PHW2的MOI也為0.1[30]。確定最佳感染復(fù)數(shù)有助于決定噬菌體制劑的最佳組成比和儲(chǔ)備濃度的有效性[38]。由于噬菌體的宿主特異性，如果將多個(gè)噬菌體混合形成“雞尾酒療法”，可以擴(kuò)大單個(gè)噬菌體的裂解譜[39]。PAMD02具有較高的裂解末期暴發(fā)量，短時(shí)間的大量復(fù)制有助于裂解相關(guān)蛋白的產(chǎn)生與聚集。PAMD02在不利環(huán)境有較好的耐受性，對(duì)氯仿不敏感，用氯仿處理宿主細(xì)菌可以提高其感染和裂解效率。PAMD02是一種dsDNA噬菌體，屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)，以可伸縮尾巴為特征的肌尾噬菌體科(Myoviridae)[40-41]。PAMD02的基因組全長為66264bp，GC含量為55.59%，顯著低于其宿主細(xì)菌(65.97%)。與A和T/U相比，G和C的合成需要更高的能源成本，因此依賴宿主細(xì)菌生存的噬菌體比宿主含有更少的G和C[42]?；蚪M測序闡明了23個(gè)具有可預(yù)測功能的蛋白質(zhì)，其13種結(jié)構(gòu)蛋白中有3種與尾部結(jié)酶蛋白。全基因組注釋表明，PAMD02不編碼毒力或耐藥基因，也不編碼tRNA，表明PAMD02未水平傳遞毒力和耐藥基因[26,43]。tRNA相關(guān)基因的缺乏與宿主特異性有關(guān)，tRNA越多，噬菌體宿主特異性越低，噬菌體裂解譜越寬[44]。這一觀察結(jié)果與我們在實(shí)驗(yàn)中的裂解譜結(jié)果一致。PAMD02在整個(gè)抗菌試驗(yàn)過程中一直具有良好的抑菌作用。在滴鼻后，抑菌組小鼠能在TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn較短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)正常進(jìn)食，精神狀況較攻毒組小鼠更好，無顫栗抱團(tuán)現(xiàn)象；抑菌組小鼠組織病理分析顯示其肺臟、肝臟受損情況均好于攻毒組小鼠，肺臟細(xì)菌載量也明顯低于攻毒組小鼠，表現(xiàn)出了明顯的抑菌效果。攻毒組小鼠24h內(nèi)死亡率為50.00%，48h內(nèi)死亡率為66.67%，抑菌組與噬菌體組小鼠無死亡，并且組織病理切片顯示其組織受損情況輕微，表明在試驗(yàn)所用濃度與劑量下PAMD02對(duì)于小鼠是安全的。目前大多數(shù)噬菌體治療都采用“雞尾酒療法”，若選擇噬菌體相關(guān)裂解蛋白作為抑菌制劑而不是整個(gè)噬菌體，或許可以避免一些潛在的問題，如水平基因轉(zhuǎn)移[45]。噬菌體相關(guān)裂解蛋白比噬菌體具有更好的裂解性能，它們可以有效地溶解細(xì)菌而不產(chǎn)生耐藥性，裂解譜也更為廣泛，更適合廣泛應(yīng)用[46]。噬菌體療法被認(rèn)為是治療耐藥性銅綠假單胞菌感染的有效措施之一[47]。近年來，已經(jīng)有很多烈性噬菌體特異性治療銅綠假單胞菌感染的研究，如特異性銅綠假單胞菌噬菌體KPP12眼藥水作為輔助或替代療法，治療感染性角膜炎中的耐藥性細(xì)菌[48]；噬菌體也被用來控制和治療多重耐藥性銅綠假單胞菌的肺部感染[49]?；撔约膊∫恢笔亲璧K林麝的人工養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要疾病，而銅綠假單胞菌是引起林麝化膿性疾病的重要病原菌之一。本研究中使用的銅綠假單胞菌為該人工養(yǎng)殖麝場的流行株，目前對(duì)于林麝化膿性疾病與病原的研究尚未涉及噬菌體，本研究分離的噬菌體PAMD02為首株針對(duì)麝源銅綠假單胞菌的噬菌體，基于本研究對(duì)PAMD02進(jìn)行的相關(guān)試驗(yàn)分析，其在小鼠體內(nèi)對(duì)銅綠假單胞菌有良好的抑菌效果，而且安全性較好，具有成為安全抑菌劑的潛力以及備為特異性生物治療劑的價(jià)值，并在林麝養(yǎng)殖業(yè)化膿性性疾病防控中有良好的應(yīng)用前景。REFERENCES[1]THIMTT,WIBOWOD,REHMBHA.Pseudomonasaeruginosabiofilms[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2020,21(22):8671.[2]QIJ,LILL,DUYJ,WANGSR,WANGJW,LUOYB,CHEJ,LUJX,LIUH,HUGC,LIJX,GONGYW,WANGGS,HUM,YANSG,LIUYQ.Theidentification,typing,andantimicrobialsusceptibilityofPseudomonasaeruginosaisolatedfromminkwithhemorrhagicpneumonia[J].VeterinaryMicrobiology,2014,170(3-4):456-461.[3]胡付品,郭燕,朱德妹,汪復(fù),蔣曉飛,徐英春,張小江,張朝霞,季萍,謝軼,康梅,王傳清,王愛敏,徐元宏,沈繼錄,孫自鏞,陳中舉,倪語星,孫景勇,褚云卓,等.2016年CHINET中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2017,17(5):481-491.HUFP,GUOY,ZHUDM,WANGF,JIANGXF,XUYC,ZHANGXJ,ZHANGZX,JIP,XIEY,KANGM,WANGCQ,WANGAM,XUYH,SHENJL,SUNZY,CHENZJ,NIYX,SUNJY,CHUYZ,etal.CHINETsurveillanceofbacterialresistanceacrossChina:reportoftheresultsin2016[J].ChineseJournalofInfectionandChemotherapy,2017,17(5):481-491(inChinese).[4]胡付品,郭燕,朱德妹,汪復(fù),蔣曉飛,徐英春,張小江,張朝霞,季萍,謝軼,康梅,王傳清,王愛敏,徐元宏,沈繼錄,孫自鏞,陳中舉,倪語星,孫景勇,褚云卓,等.2017年CHINET中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2018,18(3):241-251.HUFP,GUOY,ZHUDM,WANGF,JIANGXF,XUYC,ZHANGXJ,ZHANGZX,JIP,XIEY,KANGM,WANGCQ,WANGAM,XUYH,SHENJL,SUNZY,CHENZJ,NIYX,SUNJY,CHUYZ,etal.AntimicrobialresistanceprofileofclinicalisolatesinhospitalsacrossChina:reportfromtheCHINETSurveillanceProgram,2017[J].ChineseJournalofInfectionandChemotherapy,2018,18(3):241-251(inChinese).[5]胡付品,郭燕,朱德妹,汪復(fù),蔣曉飛,徐英春,張小江,張朝霞,季萍,謝軼,康梅,王傳清,王愛敏,徐元宏,沈繼錄,孫自鏞,陳中舉,倪語星,孫景勇,褚云卓,等.2018年CHINET中國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2020,20(1):1-10.HUFP,GUOY,ZHUDM,WANGF,JIANGXF,XUYC,ZHANGXJ,ZHANGZX,JIP,XIEY,KANGM,WANGCQ,WANGAM,XUYH,SHENJL,SUNZY,CHENZJ,NIYX,SUNJY,CHUYZ,etal.CHINETsurveillanceofbacterialresistanceinChina:2018TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn3032微生物學(xué)通報(bào)report[J].ChineseJournalofInfectionandChemotherapy,2020,20(1):1-10(inChinese).[6]中國抗菌藥物耐藥性監(jiān)測系統(tǒng).全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)2014–2019年血標(biāo)本病原菌耐藥性變遷[J].中國感染控制雜志,2021,20(2):124-133.SYSTEMCARS.Changeinantimicrobialresistanceofpathogensfrombloodspecimens:surveillancereportfromChinaAntimicrobialResistanceSurveillanceSystemin2014–2019[J].ChineseJournalofInfectionControl,2021,20(2):124-133(inChinese).[7]胡付品,郭燕,朱德妹,汪復(fù),蔣曉飛,徐英春,張小江,張朝霞,季萍,謝軼,康梅,王傳清,王愛敏,徐元宏,黃穎,孫自鏞,陳中舉,倪語星,孫景勇,褚云卓,等.2021年CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測[J].中國感染與化療雜志,2022,22(5):521-530.HUFP,GUOY,ZHUDM,WANGF,JIANGXF,XUYC,ZHANGXJ,ZHANGZX,JIP,XIEY,KANGM,WANGCQ,WANGAM,XUYH,HUANGY,SUNZY,CHENZJ,NIYX,SUNJY,CHUYZ,etal.CHINETsurveillanceofantimicrobialresistanceamongthebacterialisolatesin2021[J].ChineseJournalofInfectionandChemotherapy,2022,22(5):521-530(inChinese).(Moschusberezovskii)研究概況和進(jìn)展[J].四川動(dòng)物,2006,25(1):195-200.WANGY,JIANGHR,XUEWJ,XUL,XUHF.Advancesinresearchofforestmuskdeer(Moschusberezovskii)[J].SichuanJournalofZoology,2006,25(1):195-200(inChinese).[9]宋興超,楊福合,邢秀梅.中國麝科動(dòng)物的種類、分布、價(jià)值及其保護(hù)對(duì)策[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2008,11(9):5-7.SONGXC,YANGFH,XINGXM.Species,distribution,valueandprotectioncountermeasuresofmuscidaeinChina[J].SpecialEconomicAnimalandPlant,2008,11(9):5-7(inChinese).[10]汪松.中國瀕危動(dòng)物紅皮書-獸類[M].北京:科學(xué)出版社,1998:237-240.WANGS.ChinaRedDataBookofEndangeredAnimals[M].Beijing:SciencePress,1998:237-240(inChinese).[11]羅燕,程建國,李秋波,蔡永華,賈煉,趙翠.麝大腸桿菌性化膿病的病原分離鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2006(11):81-83.LUOY,CHENGJG,LIQB,CAIYH,JIAL,ZHAOC.IsolationandidentificationofthepathogenofEscherichiacolisuppurativediseaseinmuskdeer[J].HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicine,2006(11):81-83(inChinese).[12]李秋波,顏其貴,康紀(jì)平,李萍,熊衛(wèi)平.麝化膿病細(xì)菌性病原診斷鑒定[J].野生動(dòng)物,2012,33(4):211-213.LIQB,YANQG,KANGJP,LIP,XIONGWP.Isolationandidentificationofpurulentbacteriafromforestmuskdeer(Moschusberezovskii)[J].ChineseJournalofWildlife,2012,33(4):211-213(inChinese).[13]唐婕,胡罕,王永奇,李斐然,劉文華.林麝化膿棒狀桿菌的分離和鑒定[J].中國草食動(dòng)物,2011,31(2):71-73.TANGJ,HUH,WANGYQ,LIFR,LIUWH.IsolationandidentificationofCorynebacteriumpyogenesfromforestmuskdeer[J].ChinaHerbivores,2011,31(2):71-73(inChinese).[14]羅燕,程建國,李秋波,陳三,蔡永華,賈煉,趙翠.麝沙門氏菌性化膿病的病原分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志,2007,43(2):22-23.LUOY,CHENGJG,LIQB,CHENS,CAIYH,JIAL,ZHAOC.IsolationandidentificationofthepathogenofSalmonellamuskdeerpurulentdisease[J].ChineseJournalofVeterinaryMedicine,2007,43(2):22-23(inChinese).[15]付文龍,付春梅,王建明,蔡永華.林麝喉頭后側(cè)深部膿腫的診斷與治療[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2010,14(4):222-224.FUWL,FUCM,WANGJM,CAIYH.Diagnosisandtreatmentofdeeppartabscessontherearwardofforestmuskdeerthroat[J].JournalofEconomicAnimal,2010,14(4):222-224(inChinese).[16]呂向輝,喬繼英,吳曉民,蘇麗娜.主要危害麝類的化膿性、呼吸系統(tǒng)疾病及寄生蟲病研究[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2009,13(2):104-107.LüXH,QIAOJY,WUXM,SULN.Areviewofmainlyaffectedonmusk-deerdiseases:purulent,respiratorysystemandparasiticdiseases[J].JournalofEconomicAnimal,2009,13(2):104-107(inChinese).[17]TWORTFW.Aninvestigationonthenatureofultra-microscopicviruses[J].TheLancet,1915,186(4814):1241-1243.[18]FORDEA,HILLC.Phagesoflife-thepathtopharma[J].BritishJournalofPharmacology,2018,175(3):412-418.[19]ALISKYJ,ICZKOWSKIK,RAPOPORTA,TROITSKYN.Bacteriophagesshowpromiseasantimicrobialagents[J].JournalofInfection,1998,36(1):5-15.TelE-mail:tongbao@;/wswxtbcn[20]CHADHAP,KATAREOP,CHHIBBERS.InvivoefficacyofsinglephageversusphagecocktailinresolvingburnwoundinfectioninBALB/cmice[J].MicrobialPathogenesis,2016,99:68-77.[21]SAUSSEREAUE,DEBARBIEUXL.BacteriophagesintheexperimentaltreatmentofPseudomonasaeruginosainfectionsinmice[J].AdvancesinVirusResearch,2012,83:123-141.[22]BRIERSY,WALMAGHM,vanPUYENBROECKV,CORNELISSENA,CENENSW,AERTSENA,OLIVEIRAH,AZEREDOJ,VERWEENG,PIRNAYJP,MILLERS,VOLCKAERTG,LAVIGNER.Engineeredendolysin-based“artilysins”tocombatmultidrug-resistantGram-negativepathogens[J].mBio,2014,5(4):e01379-14.B,KUCHAREWICZ-KRUKOWSKAA,DABROWSKIM,BISIKIEWICZR.Resultsofbacteriophagetreatmentofsuppurativebacterialinfections.II.Detailedevaluationoftheresults[J].ArchivumImmunologiaeetTherapiaeExperimentalis,1983,31(3):293-327.[24]GORDILLOALTAMIRANOFL,BARRJJ.Phagetherapyinthepostantibioticera[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2019,32(2):e00066-e00018.[25]SKURNIKM,STRAUCHE.Phagetherapy:factsandfiction[J].InternationalJournalofMedicalMicrobiology,2006,296(1):5-14.[26]WRIGHTA,HAWKINSCH,ANGG?RDEE,HARPERDR.Acontrolledclinicaltrialofatherapeuticbacteriophagepreparationinchronicotitisduetoantibiotic-resistantPseudomonasaeruginosa;apreliminaryreportofefficacy[J].ClinicalOtolaryngology:OfficialJournalofENT-UK;OfficialJournalofNetherlandsSocietyforOto-Rhino-Laryngology&Cervico-FacialSurgery,2009,34(4):349-357.[27]伍茜,楊威,趙位,程建國,羅燕,王印,楊澤曉,姚學(xué)萍.林麝肺源ST1249型銅綠假單胞菌的分離鑒定及其全基因組序列分析[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020,48(10):9-17.WUX,YANGW,ZHAOW,CHENGJG,LUOY,WANGY,YANGZX,YAOXP.Isolation,identificationandwholegenomesequenceanalysisofPseudomonasaeruginosa(ST1249)fromlungofforestmuskdeer[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition),2020,48(10):9-17(inChinese).[28]CHANGHC,CHENCR,LINJW,SHENGH,CHANGKM,TSENGYH,WENGSF.IsolationandcharacterizationofnovelgiantStenotrophomonasmaltophiliaphagephiSMA5[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2005,71(3):1387-1393.[29]KUTTERE.Phagehostrangeandefficiencyofplating[J].MethodsinMolecularBiology(Clifton,NJ),2009,501:141-149.[30]吳芷瑩,金澤源,李萬霞,曾飛,朱明卓,陳少賢,彭文儀,徐艷萍,童貽剛,柏琴琴.PB1樣銅綠假單胞菌噬菌體PHW2的生物學(xué)特性[J].微生物學(xué)通報(bào),2021,48(9):3205-3217.WUZY,JINZY,LIWX,ZENGF,ZHUMZ,CHENSX,PENGWY,XUYP,TONGYG,BAIQQ.CharacterizationofaPB1-likephagePHW2infectingPseudomonasaeruginosa[J].MicrobiologyChina,2021,48(9):3205-3217(inChinese).[31]JACKMANSD,VANDERVALKBP,MOHAMADIH,CHUJ,YEOS,HAMMONDSA,JAHESHG,KHANH,COOMBEL,WARRENRL,BIROLI.ABySS2.0:resource-efficientassemblyoflargegenomesusingaBloomfilter[J].GenomeResearch,2017,27(5):768-777.[32]CHEVREUXB,WETTERT,SUHAIS.Genomesequenceassemblyusingtracesignalsandadditionalsequenceinformation[C].Germanconferenceonbioinformatics,1999,99(1):45-46.[33]BESEMERJ,BORODOVSKYM.GeneMark:websoftwareforgenefindinginprokaryotes,eukaryotesandv