基因診斷與基因治療

GeneDiagnosisandGeneTherapy第二十八章第一節(jié)基因診斷學基礎(chǔ)第二節(jié)遺傳病的基因診斷第三節(jié)傳染病的基因診斷第四節(jié)腫瘤的基因診斷第五節(jié)基因診斷在法醫(yī)學上的應用

第六節(jié)基因治療的概念及策略

本章內(nèi)容提要第一節(jié)

基因診斷學基礎(chǔ)

BasisofGeneDiagnostics基因診斷之父—簡悅威1976年加州大學華裔科學家KanYW用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例α地中海貧血進行診斷。一、基因診斷的概念、特點及臨床意義

定義：利用分子生物學技術(shù)，通過檢測基因及基因表達產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對人體疾病作出診斷的方法?；蛟\斷檢測的目標分子是DNA、RNA，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。

診斷依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變)DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達水平從低到高；基因結(jié)構(gòu)變化，如點突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活?；蛟\斷的特點高特異性高靈敏性早期診斷性應用廣泛性二、基因診斷中常用的分子生物學技術(shù)核酸分子雜交（Nucleicacidhybridization）聚合酶鏈式反應(PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）DNA序列測定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印跡（Westernblotting）免疫組織化學診斷（一）核酸分子雜交

Nucleicacidhybridization指兩條單鏈核酸在一定條件（溫度、鹽離子和有機溶劑濃度）下，按堿基互補的原則重新配對形成雙鏈的過程。核酸分子雜交流程

待測核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測雜交信號核酸探針制備探針標記加入標記探針提取DNA→限制性內(nèi)切酶消化DNA以產(chǎn)生特定長度的片段→凝膠電泳分離→變性處理→DNA轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合→將標記的探針與膜上DNA片段雜交，分析雜交信號。1.Southern印跡雜交(Southernblotting)RNA經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過分子雜交檢測特定的mRNA分子的含量與大小。2.Northern印跡雜交(Northernblotting)3.斑點雜交（dotblotting）將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達產(chǎn)物的定性及定量的研究。4.反向斑點雜交

（reversedotblotting）先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品RNA或DNA標記變性后進行雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率。

寡核苷酸中的堿基錯配會大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對正常和突變ASO探針進行反向斑點雜交，檢測點突變，大大提高檢測結(jié)果的可靠性。等位基因特異性寡核苷酸

(allelespecificoligonucleotide,ASO）5.原位分子雜交熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）掛鎖FISH(FISHwithpadlock)

熒光原位雜交（FISH）6.固相夾心雜交法

(sandwichhybridization)

待測靶基因序列上兩個相鄰但不重疊的DNA片段（A、B片段），分別作為捕捉探針（不標記的A片段）和檢測探針（標記的B片段），同時與靶基因雜交。先將捕捉探針吸附于固相支持物上，與靶基因序列A部分雜交，再加入標記的檢測探針，檢測探針與靶基因序列B部分雜交，檢測雜交信號。固相夾心雜交法示意圖

（二）聚合酶鏈式反應

(polymerasechainreaction,PCR）模板引物dNTPMg2+

TaqDNA聚合酶變性延伸退火PCR在基因診斷中的應用RT-PCR熒光定量PCR多重-PCRPCR-ASOAS-PCRPCR-SSCPPCR-RFLP1.RT-PCR2.熒光定量PCR熒光標記引物

3.多重PCR多重PCR示意圖A：普通PCR；B：多重PCR4.PCR-ASON：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因ASO1ASO2NHM（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）

DNA的突變造成DNA片段中堿基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開來。PCR-SSCP分析原理示意正常人純合突變雜合突變+PCR-SSCP分析

－（四）限制性片段長度多態(tài)性分析

（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）

由于DNA變異產(chǎn)生新的酶切位點或原有的酶切位點消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時產(chǎn)生不同長度或不同數(shù)量的片段。可借助核酸分子雜交或PCR進行檢測。

設(shè)計適當?shù)臄U增引物，使擴增片段包括某一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別序列，在PCR擴增后用該限制酶切割PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長度變化，即可作出診斷。PCR-RFLPABCDEFG－＋DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG－＋C+DAEcoRⅠ限制性內(nèi)切酶位點的變化（五）DNA序列測定（DNAsequencing）DNA序列測定原理(雙脫氧末端終止法)左側(cè)：正常；右側(cè)突變序列分析用于基因診斷研究（六）生物芯片（biochips）基因芯片（genechips）蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)

基因芯片雜交流程示意圖基因診斷中常用的分子生物學方法比較方法優(yōu)點與問題解決方案核酸分子雜交結(jié)果可靠但操作繁瑣選擇合適的探針PCR靈敏度、特異性高設(shè)計合適的引物SSCP操作簡便、檢出率不高選擇合適的片段RFLP結(jié)果可靠但限制較多選擇合適的限制酶DNA測序可自動化，但不適宜廣泛使用與PCR配合使用生物芯片效率高，成本高，不適宜廣泛使用選擇合適的芯片三、基因診斷技術(shù)路線與方法

直接診斷：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達是否異常間接診斷：利用多態(tài)性遺傳標志與致病基因進行連鎖分析根據(jù)對致病基因或相關(guān)基因的了解程度決定基因診斷的技術(shù)途徑選擇。（一）直接診斷途徑

必要條件：◆被檢測基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系◆被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定◆被檢基因致病的分子機制（突變位點或表達變化）已知5/——5/—3/3/—RFLP1.點突變的檢測

（1）有限制性內(nèi)切酶位點改變斑點雜交、反向斑點雜交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR產(chǎn)物直接測序5/——5/—3/3/—（2）無限制性酶切位點改變

在DNA序列上有一段較長序列的重新排布。包括數(shù)十個堿基到數(shù)千個堿基的丟失、插入、替換、重復和倒位等，以及染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等。

2.基因重排的檢測核酸分子探針雜交與PCRBamHIBamHIα2α1α2

10kb14kbprobe-珠蛋白生成障礙性貧血的直接基因診斷-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同類型的-珠蛋白生成障礙性貧血根據(jù)引物3′端的互補與否，設(shè)計一對與正常或突變模板配對的特異引物

等位基因特異PCRAS-PCR（allelespecificPCR）3.基因表達異常的檢測

mRNA的相對定量分析mRNA的絕對定量分析

mRNA長度分析（二）間接診斷途徑1.采用原因致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定致病突變機制不清致病位點不便檢測

DNA多態(tài)性：指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型，即個體間同一染色體的相同位置上核苷酸序列存在一定的差異或變異。多在進化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。2.遺傳標記間接診斷：檢測與致病基因連鎖的遺傳標記三代遺傳標記：

RFLP（基于核酸分子雜交技術(shù)）

VNTR(variablenumberoftandemrepeats);

STR(shorttandemrepeats)

SNP(singlenucleotidepolymorphism)7.6kb13kb患者正常HBS的間接基因診斷

——RFLP標記的連鎖分析HapⅠ7.6kb13kbSouthern印跡雜交NHPN：正常；H：雜合子；P：患者（純合子）；黃色區(qū)域為探針

第二節(jié)

遺傳病的基因診斷

GeneDiagnosisofHereditaryDiseases一、血紅蛋白?。╤emoglobinopathy）

（一）鐮狀細胞貧血?。ǘ│?珠蛋白生成障礙性貧血癥

二、血友病（Hemophilia）甲型血友病基因診斷

三、脆性X綜合征

（一）鐮狀細胞貧血病一、血紅蛋白病1.鐮狀紅細胞貧血患者基因診斷——ASO雜交法

2.HBS的限制性內(nèi)切酶譜分析

3.HBS的PCR-RFLP分析

正常的（N）的ASO探針：5′-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3′突變的（M）的ASO探針：5′-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3′1.鐮狀紅細胞貧血患者基因診斷

ASO雜交法斑點雜交結(jié)果N：正常；M突變鐮狀紅細胞貧血患者ASO雜交法檢測N-ASOM-ASO正常突變突變

純合子雜合子純合子5′3′正常基因1.15kb(CCTGAGG)×5′3′突變基因1.35kb(CCTGTGG)鐮狀紅細胞貧病的限制性內(nèi)切酶譜分析MstⅡ酶切位點（CCTNAGG）2.HBS的限制性內(nèi)切酶譜分析目錄0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細胞貧血病的限制性內(nèi)切酶譜分析目錄3.HBS的PCR-RFLP分析

正常人的擴增產(chǎn)物經(jīng)MstⅡ消化可生成54bp和56bp兩個片段，而鐮狀細胞貧血癥患者的DNA片段不被酶切，仍為110bp，雜合子可見三條帶正常人雜合體患者Marker1.PCR-RFLP分析

-珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子17突變的檢測M：pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段；2：bA/bA；

3：bA/bT；4：bT/bT注：由于54bp、114bp、72bp片段及分子量標準中低于200bp的片段太小，在0.8％的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到（二）-珠蛋白生成障礙性貧血癥-珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點雜交分析2.反向斑點雜交二、血友病（Hemophilia）甲型血友病是由于血漿凝血因子VIII（FVIII）缺陷造成。甲型血友病的基因突變類型已有300余種，其中點突變占174種；另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子22的基因倒位所致。1.FVIII基因倒位的DNA印跡分析將基因組DNA用NcoI，DraI或BclI等內(nèi)切酶（酶切位點位于交換點兩側(cè)）消化，用特異探針進行雜交分析，正常人表現(xiàn)為21.5kb、14kb和16kb三種類型。I型倒位患者表現(xiàn)為20、17.5和14kb三種類型；Ⅱ型倒位患者表現(xiàn)為20、16和15.5kb三種帶型。在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。

2.FVIII基因突變的檢測（1）依賴于FVIII基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標記的連鎖分析（2）RFLP連鎖分析（3）VNTR分析（4）短串聯(lián)重復序列（STR）的連鎖分析三、脆性X綜合征脆性X智力低下基因1（FMR1）5ˊ非翻譯區(qū)遺傳不穩(wěn)定的(CGG)n三核苷酸重復序列的異常擴增以及相鄰CpG島的異常甲基化。正常人中約為8～50拷貝。男性和女性攜帶者增多到52～200拷貝，相鄰的CpG島未被甲基化，稱為前突變（premutation）。男性患者和脆性部位高表達的女性中，達到200～1000拷貝，相鄰的CpG島也被甲基化，稱為全突變（fullmutation）。全突變可關(guān)閉相鄰FMR1基因的表達，F(xiàn)MR1mRNA在幾乎所有患者不表達或只有低表達，從而出現(xiàn)臨床癥狀。脆性X綜合征常用基因診斷方法1．PCR-ASO2．DNA連鎖分析3．Souhern印跡雜交法4．PCR擴增

第三節(jié)

傳染病的基因診斷

GeneDiagnosisofInfectiousDiseases目錄

一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（HAV）

HAV系RNA病毒，利用RT-PCR技術(shù)可從糞便中檢測出甲型肝炎病毒的基因組RNA。

乙型肝炎病毒（HBV）設(shè)計保守區(qū)序列引物，擴增各型HBVDNA片段；設(shè)計位于可變區(qū)的引物擴增某一亞型HBVDNA，以便分型。丙型肝炎病毒（HCV）

HCV為正鏈RNA病毒，先反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進行巢式PCR檢測HCV。

目錄二、細菌引起的疾病結(jié)核分枝桿菌先設(shè)計一對特異性引物，用PCR技術(shù)擴增出一383bp序列，再用探針雜交，靈敏度可達到100個細菌水平。幽門螺桿菌（HP）主要采用PCR技術(shù)：①檢測HP染色體DNA特異片段；②檢測HP尿素酶A基因；③用PCR-RFLP鑒別HP菌株。三、寄生蟲及衣原體感染瘧原蟲卡氏肺孢子蟲衣原體感染

診斷方法：核酸雜交和PCR技術(shù)

第四節(jié)

腫瘤的基因診斷

GeneDiagnosisofMalignantTumors一、原癌基因與抑癌基因的檢測二、常見腫瘤的基因診斷

乳腺癌結(jié)腸癌一、原癌基因與抑癌基因的檢測1．原癌基因的檢測

ras

基因家族由H-ras、K-ras和N-ras組成。最常見的突變是第12、13、59或第61位密碼子的點突變。胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以K-ras突變?yōu)橹鳎绲?2位密碼子突變，由編碼甘氨酸的GGT突變?yōu)門GT、GTT或GAT，少數(shù)突變?yōu)镚CT。急性淋巴細胞白血病，慢性淋巴細胞白血病等以N-ras突變?yōu)橹?；泌尿系統(tǒng)腫瘤則以H-ras突變?yōu)橹?。PCR及PCR-SSCP分析：擴增ras基因第12位密碼子點突變部位，再用SSCP技術(shù)進行分析，或者直接測序確定患者ras原癌基因的點突變。

核苷酸雜交技術(shù)（如ASO）：檢測ras基因第12位密碼子點突變。2.ras原癌基因突變常用的檢測方法3．抑癌基因p53的檢測p53基因以密碼子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位點突變率最高。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、小細胞肺癌，都可見異常的p53基因蛋白。p53的基因診斷方法有（1）PCR-SSCP分析技術(shù)（2）DNA序列分析（3）PCR-RFLP分析（一）乳腺癌1．乳腺癌常見基因變異5%～10%乳腺癌患者有家族遺傳性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的BRCA基因（breastcancergene）的突變。BRAC1突變易致乳腺癌。突變分布于整個編碼序列，沒有明顯的突變簇或突變熱點。70%的缺失或插入導致編碼序列的框移和翻譯提前終止。BRCA1在N端的一半部位截短，與乳腺癌和卵巢癌的高風險相關(guān)；而在C端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān)。BRCA2基因在30%～40%的散發(fā)性乳腺癌有雜合性缺失（LOH）。突變提高乳腺癌易感性。二、常見腫瘤的基因診斷（1）PCR法檢測BRCA1基因突變（2）熒光原位雜交（FISH）檢測BRCA2基因擴增2．乳腺癌基因診斷方法（二）結(jié)腸癌1.結(jié)腸癌常見基因變異在癌發(fā)展過程的不同階段發(fā)生不同的基因突變。APC（adenomatouspolyposiscoli）是結(jié)腸癌發(fā)生過程中第一個突變基因。K-ras原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。DCC（deletionofcolorectalcancer）基因失活是結(jié)腸癌發(fā)展的晚期事件。抑癌基因DPC4和MADR2也可能會因18q等位基因丟失而失活。p53基因的突變是結(jié)腸癌發(fā)展過程的晚期現(xiàn)象。DNA修復基因也與結(jié)腸癌有關(guān)。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因的突變所致的DNA錯配修復缺陷與遺傳性非息肉性結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。二、常見腫瘤的基因診斷（1）PCR-SSCP法：對腺瘤樣息肉病人APC基因PCR-SSCP技術(shù)進行分析。（2）異源雙鏈PCR法：檢測APC基因變異。（3）蛋白質(zhì)免疫印跡法：檢測因基因突變而縮短了的APC蛋白。

2．結(jié)腸癌基因診斷方法第五節(jié)

基因診斷在法醫(yī)學上的應用

ApplicationofGeneDiagnosis

inForensicMedicine

目錄重復序列以各自核心序列（重復單元）首尾相連多次重復，稱為串聯(lián)重復序列，其重復次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性。串聯(lián)重復序列散在分布于染色體上。重復單位6～25bp長，稱為小衛(wèi)星DNA。

重復單位2～6bp長，如（TA）n,(CGG)n等，稱為微衛(wèi)星DNA。一、DNA指紋與多態(tài)性遺傳標記

可變數(shù)目串聯(lián)重復序列(VNTR)

人類染色體上小衛(wèi)星DNA的高度可變區(qū)（HVR）是由頭尾相連的串聯(lián)重復序列（tandemrepeat，TR）組成，TR的核心序列同源性很高，等位HVR的長度由于TR的重復次數(shù)不同而有很大的差別，具高度多態(tài)性。

DNA長度多態(tài)除可用Southern印跡雜交法檢測外，還可以通過PCR擴增后電泳來檢出。擴增片段長度多態(tài)（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）1985年，英國遺傳學家Jeffeys等人用TR的核心序列為探針進行RFLP分析時，檢測到許多HVR，并產(chǎn)生相應的圖譜，所得圖譜具有高度的個體特異性，達到了如同人類指紋那樣的高度專一性，所以稱其為DNA指紋圖譜（DNAfingerprinting）。

AlecJohnJeffreysOxford,UnitedKingdom

目錄人類DNA指紋圖二、DNA指紋與法醫(yī)學診斷個體識別和親子鑒定：DNA指紋技術(shù)是從基因水平檢測DNA的高度多態(tài)性，個體識別率高。以往在刑事案件的法醫(yī)學鑒定中應用的是血型、血清蛋白型、紅細胞酶型和HLA分型，個體分辨能力不夠，只能排除，不能做到統(tǒng)一認證。法醫(yī)案檢中的基因診斷技術(shù)VNTR（可變數(shù)目串聯(lián)重復序列/小衛(wèi)星）的核酸分子雜交分析STR（短串聯(lián)重復序列/微衛(wèi)星）的PCR分析SNP的基因芯片檢測1．單位點探針檢測及PI值的計算父權(quán)指數(shù)（PaternityIndex，PI）值、父權(quán)相對指數(shù)或親子關(guān)系概率值計算方法基本一致。PI值表示爭議父作為親父比隨機男人作為親父的可能性大多少倍，PI值大于1表示傾向肯定父子關(guān)系，數(shù)值越大，可能性越大；等于0時表示排除父子關(guān)系。2．DNA指紋圖與親權(quán)鑒定多位點VNTR系統(tǒng)和DNA指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率分布的計算復雜，進行親權(quán)鑒定和個體識別時匹配概率的計算影響因素較多，目前尚無一個公認的最合理的計算方法。目前解決親權(quán)糾紛最簡單的辦法是先在孩子DNA指紋圖中找出非母片段并計數(shù)為P，然后分析爭議父DNA指紋圖，看P條非母帶在爭議父中出現(xiàn)多少條。親權(quán)鑒定與DNA指紋圖由此圖可推斷出：A和C是親生女兒；B為妻子和其前夫所生；D為養(yǎng)女。第六節(jié)

基因治療的概念及策略

ConceptandStrategyofGeneTherapy目錄基因治療：指將目的基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（病毒載體介導或者非病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）導入靶細胞內(nèi)，目的基因表達產(chǎn)物對疾病起治療作用。

目錄

狹義基因治療：指目的基因?qū)氚屑毎笈c宿主細胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因表達產(chǎn)物起治療疾病的作用。廣義基因治療：

①外源正?；?qū)氩∽兗毎a(chǎn)生正?；虻谋磉_產(chǎn)物以補充缺失的或失去正常功能的蛋白質(zhì)；②采用適當?shù)募夹g(shù)抑制細胞內(nèi)過度表達的基因；③將特定的基因?qū)敕遣∽兗毎隗w內(nèi)表達特定產(chǎn)物；④向功能異常的細胞（腫瘤細胞）中導入該細胞中本來不存在的基因（如自殺基因），利用這些基因的表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的。目錄本節(jié)內(nèi)容提要

一、基因治療的策略

二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

三、基因干預

四、基因治療的應用研究

五、基因治療的前景與問題目錄基因治療分類體細胞(somaticcell)基因治療生殖細胞(germline)基因治療只限于某一體細胞的基因的改變只限于某個體的當代對缺陷的生殖細胞進行矯正當代及子代一、基因治療的策略

（一）基因置換（genereplacement）

定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟毎?，通過定位重組，導入的正常基因，以置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進行橋正。對缺陷基因的缺陷部位進行精確的原位修復，不涉及基因組的任何改變。定向整合的條件:轉(zhuǎn)導基因的載體與基因組DNA具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點，進行部分基因序列的交換?；蛲粗亟M技術(shù)又稱為基因打靶(genetargeting）細胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低?；蛲粗亟M技術(shù)（二）基因添加（geneaugmentation）

定義:

通過導入外源基因使靶細胞表達其本身不表達的基因。類型:在有缺陷基因的細胞中導入相應的正?；?，而細胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導入正常基因的表達產(chǎn)物，補償缺陷基因的功能；向靶細胞中導入靶細胞本來不表達的基因，利用其表達產(chǎn)物達到治療疾病的目的。（三）基因干預（geneinterference）

定義：采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達，以達到治療疾病的目的。定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷毎?，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞產(chǎn)生“自殺”效應，從而達到清除腫瘤細胞的目的。應用：是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。（四）自殺基因治療(SuicideGeneTherapy)自殺基因的作用機制

?TK/GCV

單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，導致細胞死亡。1.自殺基因系統(tǒng)定義:“自殺基因”導入后，不僅使轉(zhuǎn)導了“自殺基因”的腫瘤細胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導“自殺基因”的腫瘤細胞也被殺死。

2.旁觀者效應（bystandereffect）（五）基因免疫治療通過將抗癌免疫增強的細胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應。二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

基因治療的兩種途徑載體目的基因invivoexvivo靶細胞目錄

基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)技術(shù)

1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移2.非病毒介導的基因轉(zhuǎn)移

1.病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計，有72%的臨床實驗計劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒

兩端各有一長末端重復序列LTR。

反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點

LTR由U3、R和U5三部分組成。病毒有三個結(jié)構(gòu)基因5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(SD)和剪接受體位點(SA)。

含有負鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點。在U3內(nèi)有增強子和啟動子；

U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)

；

在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。

gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；pol基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

反轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

——由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體：其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號ψ，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆并表達外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。

輔助細胞株(如PA317)：由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信號ψ的反轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成。能合成包裝蛋白，用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。

Retroviralpackagingsystem

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點

①反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上env編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動物細胞膜上的特異性受體識別，從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進入靶細胞。

②反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒通過LTR高效整合至靶細胞基因組中，有利于外源基因在靶細胞中的永久表達。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點

隨機整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險；反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。

（2）腺病毒(adenovirus)載體

腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導的內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進入宿主細胞基因組中。腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細胞，如神經(jīng)元等。

目錄腺病毒的優(yōu)點基因?qū)胄矢?，對人類安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導與細胞分裂無關(guān)；重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大，可插入7.5kb外源基因。目錄

腺病毒載體缺點宿主的免疫反應導致腺病毒載體表達短暫。有兩個環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復制型腺病毒。靶向性差。

不能整合到靶細胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細胞，導入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機會增多，表達時間相對較短。（3）腺病毒相關(guān)病毒載體

一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒。其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨立復制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒等）存在時，才能進行復制和溶細胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticlesStructureofAAVVirusGenomicDNAREP：病毒復制基因,CAP：編碼衣殼蛋白的基因ITR：反向末端重復序列AAV的特點以潛伏感染為主；病毒基因組與細胞共存；只要宿主細胞正常，AAV基因表達被抑制而維持潛伏狀態(tài)；若細胞受刺激，表達應激基因，AAV基因表達從而使AAV病毒復制；產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細胞，建立新的潛伏狀態(tài)。AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。

AAV可以高效定點整合至人19號染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點整合可以避免隨機整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點。

目錄

AAV載體的缺陷

AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低,在40%~80%的成人中存在過感染;可能會引起免疫排斥。常用基因治療載體

整合致病性感染細胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機整合，效率高可能致病分裂細胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細胞、非分裂細胞

腺相關(guān)病毒載體定點整合(19號染色體特定區(qū)域)不致病分裂細胞、非分裂細胞<5kb<7.5kb

2.非病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉?；驹?利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細胞一起孵育，即可通過細胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，并進行表達。

脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)移示意圖目錄

（2）受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)

將DNA與細胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子（如多聚賴氨酸）來實現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價連接后，又通過電荷相互作用與帶負電荷的DNA結(jié)合，將DNA包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復合物可被帶有特異性受體的靶細胞吞飲，從而將外源DNA導入靶細胞。受體介導轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖目錄

（3）基因直接注射技術(shù)

不需要進行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露DNA注入動物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動物實驗表明：接受注射外源DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應的蛋白質(zhì)，并能維持數(shù)月之久。

將促進心臟血管生長的基因直接注入實驗鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子Ⅸ。

基因直接注射法的優(yōu)點制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易；排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；導入的基因不需整合即可表達，避免了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點；基因直接注射法可反復使用，而病毒載體則可能誘導體內(nèi)免疫應答，致使反復治療效果下降。

三、基因干預

（geneinterference）

（一）反義RNA（antisenseRNA）

1.反義RNA與基因表達調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細胞進行基因表達調(diào)控，通常采用的方法有兩種：

（1）體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細胞，細胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。

反義RNA的關(guān)鍵技術(shù)問題?反義RNA進入靶細胞前的降解問題?專一性轉(zhuǎn)移問題2.受體介導反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)①受體介導的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護層,可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。借助前述的受體介導基因轉(zhuǎn)移方法，可以實現(xiàn)受體介導的反義RNA轉(zhuǎn)移。

3.反義RNA的優(yōu)點

受體介導的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點，而在一定程度上補充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。

（l）安全性高（2）反義RNA設(shè)計和制備方便

（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應

（4）能直接作用于一些RNA病毒（二）核酶(ribozyme)

天然核酶多為單一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個RNA分子組成。在基因治療時，利用核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當?shù)牟课?，形成錘頭狀核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子而達到治療疾病的目的。

核酶錘頭狀的二級、三級結(jié)構(gòu)只要兩個RNA分子通過互補序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級結(jié)構(gòu)（3個螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個或11個保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應。目錄

1.核酶的設(shè)計核酶是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個方面來設(shè)計核酶。

（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導序列。核酶的作用機制

2.核酶的應用與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。

（三）干擾RNA

1.RNA干擾現(xiàn)象RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制該基因的表達。有義RNA（senseRNA）或反義RNA（antisenseRNA）均能抑制線蟲基因的表達，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達的效率比反義RNA至少高2個數(shù)量級。

2.RNA干擾的機制

RNA干擾過程主要有2個步驟：

（1）小干擾性RNA（siRNA）（2）siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復合體，稱為RNA誘導的沉默復合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。該復合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷長雙鏈RNA被細胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶Dicer切成21~23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）RNA干擾機制示意圖研究基因功能的新工具

由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。

RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動物中抑制特定基因的表達，建立多種表型；抑制基因表達的時間可以控制在發(fā)育的任何階段。

1.體外化學合成;2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。siRNA的產(chǎn)生四、基因治療的應用研究

（一）遺傳病的基因治療研究

(一)遺傳病基因治療必須符合以下要求1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞中表達并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病。腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病血友病和其他血漿蛋白缺乏癥苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病萊-納(Lesch-Nyhan)綜合征家族性高膽固醇血癥囊性纖維化病目錄（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）通過基因置換和基因補充，導入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；腫瘤發(fā)生是一個極為復雜的過程，許多基因的突變會導致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強腫瘤細胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進行細胞因子修飾，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細胞的溶解和排斥反應；（4）通過導入“自殺基因”殺傷癌細胞。

腫瘤基因治療的常用方法

?基因干預技術(shù)：通過基因干預，抑制腫瘤細胞中過度表達的癌基因，從而降低其惡性表型。?自殺基因治療：直接殺死腫瘤細胞。?腫瘤的免疫基因治療：激發(fā)機體腫瘤免疫效應或提高免疫效應細胞功能。?提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏基因治療；耐藥基因治療。

自殺基因治療

基本原理：向腫瘤細胞內(nèi)導入某些真核細胞中不存在的酶基因（自殺基因），這些基因表達的特異性酶可以催化對真核細胞無毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚目勾x藥物，進而選擇性地使轉(zhuǎn)染了“自殺基因”的腫瘤細胞“自殺”。自殺基因治療是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點之一。

腫瘤的免疫基因治療

激發(fā)機體腫瘤免疫效應或提高免疫效應細胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。

主要包括：細胞因子（或受體）基因治療；抗原抗體基因治療。

臨床上對腫瘤患者進行化療時，通常面臨兩大難題：（1）患者機體內(nèi)的腫瘤細胞對化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐受，最終導致化療失敗。（2）大劑量的化療可能導致患者的正常細胞，特別是骨髓造血細胞的功能受到抑制。

藥物增敏基因治療：

為了使化療藥物能夠最大程度地殺死腫瘤細胞，可以將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細胞，特別是對化療藥物原本不敏感的腫瘤細胞，使其對抗腫瘤藥物的敏感性大大增加，從而達到增強化療效果的目的。

提高化療效果的輔助基因治療耐藥基因治療：腫瘤細胞耐藥性與多種糖蛋白或酶：多藥耐藥（mdr-1）基因編碼的P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）以及肺耐藥相關(guān)蛋白等；細胞內(nèi)氧化和解毒作用的酶系統(tǒng)：細胞色素P-450（cytochromeP-450）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）等。向腫瘤患者的骨髓細胞導入某種耐藥基因，增強骨髓細胞的抗藥性，以便耐受大劑量的化療藥物，達到徹底殺滅腫瘤細胞的目的。（三）病毒性疾病的基因治療研究據(jù)統(tǒng)計，75%的人類傳染病是由病毒引起的。病毒感染人體后不僅可能急性發(fā)病，還可以在人體內(nèi)長期潛伏，造成終身傷害。病毒還是造成先天畸形的重要因素之一。它與某些癌癥、自身免疫性疾病和內(nèi)分泌疾病也存在一定的關(guān)聯(lián)。臨床上對絕大多數(shù)病毒感染性疾病仍然缺乏有效的治療手段，在眾多開展的抗病毒治療方案中，抗病毒基因治療十分引人注目。1．調(diào)節(jié)機體免疫應答（1）將細胞因子(如干擾素、白細胞介素等)的基因，導入機體免疫細胞，激活免疫細胞并促進其增殖分化，增強機體的細胞和體液免疫應答，促進機體清除病毒感染的細胞和游離病毒。（2）將能夠誘導機體產(chǎn)生保護性免疫應答的病毒抗原基因，如乙型肝炎病毒表面抗原基因等，導入機體，表達的抗原不僅可以誘導機體產(chǎn)生保護性抗體，還可以引發(fā)特異性的細胞免疫應答，產(chǎn)生對野生型致病病毒攻擊的防御作用。2.抗病毒復制：根據(jù)病毒在機體細胞中復制周期的各個環(huán)節(jié)來設(shè)計的（1）抑制病毒與宿主細胞結(jié)合：即阻斷病毒表面抗原決定簇與宿主細胞受體間的特異性結(jié)合。

（2）干擾病毒基因組的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控。

（3）抑制病毒基因組的復制和蛋白質(zhì)合成。

（4）RNA干擾技術(shù)。

（5）將抗病毒蛋白質(zhì)基因，如2'→5'腺苷酸合成酶等基因，導入細胞并持續(xù)表達，可以激活核酸酶F，降解病毒RNA。主要包括：

五、基因治療的問題與展望治療基因調(diào)控元件的選擇安全高效載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)移技術(shù)的選擇靶細胞的選擇160謝謝！樹立質(zhì)量法制觀念、提高全員質(zhì)量意識。7月-237月-23Wednesday,July26,2023人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。03:11:1903:11:1903:117/26/20233:11:19AM