紅酵母的性質(zhì)及其應(yīng)用研究紅酵母及其培養(yǎng)方法和在生產(chǎn)生物油脂中的應(yīng)用與流程本發(fā)明涉及一株紅酵母，其培養(yǎng)方法以及在生產(chǎn)生物油脂中的應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：生物柴油是以生物油脂為原料，經(jīng)簡單化學(xué)加工制成的可再生燃料，其與石化柴油熱值相近，但污染物排放量低于后者，是較為理想的生物燃料之一。當(dāng)前生產(chǎn)生物柴油的原料主要來自于植物油和部分動物脂肪。油脂原料供應(yīng)受氣候、環(huán)境的影響較大，數(shù)量和質(zhì)量存在波動，不利于生物柴油的規(guī)?；a(chǎn)。產(chǎn)油微生物(oleaginousmicroorganisms)在一定條件下能將碳水化合物、碳氫化合物以及普通油脂等作為碳源轉(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量儲存油脂，且儲存的量超過生物量的20％，主要有酵母、霉菌、絲狀真菌、藻類和細菌等。產(chǎn)油微生物生長環(huán)境可控，受外界影響較小，是今后油脂生產(chǎn)的發(fā)展方向之一。其中酵母、霉菌和藻類合成的甘油三酯與植物油脂組成相似，更有利于與現(xiàn)有生物柴油生產(chǎn)工藝結(jié)合。因此，已報道的產(chǎn)油微生物以酵母菌和霉菌類真菌居多。紅酵母屬真菌(rhodotorulaspp.)作為一類可以大量積累生物油脂的微生物，具有培養(yǎng)條件簡單、油脂轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵成本低、周期短、發(fā)酵過程易于控制等優(yōu)點，是目前研究最廣泛的菌種之一。例如li等發(fā)現(xiàn)圓紅冬孢酵母y4菌株在合適培養(yǎng)條件下能累積超過自身干重70％以上的油脂(liyh,liub,zhaozb.optimizationofcultureconditionsforlipidproductionbyrhodosporidiumtoruloides[j].chinjbiotechnol,2006,22(4):650-656.)。但是，紅酵母細胞在合成生物油脂同時還會積累一定量的胡蘿卜素類色素，菌株呈橙色至深紅色。在油脂提取過程中，色素會不可避免的溶于提取產(chǎn)物中，造成產(chǎn)物雜質(zhì)含量增加、感官和質(zhì)量下降。這一缺陷使得油脂后提取工藝復(fù)雜成本增加，不利于紅酵母的工業(yè)化應(yīng)用。另外，紅酵母菌株發(fā)酵最適溫度通常在28～33℃，發(fā)酵過程中將消耗大量冷卻水，造成水資源浪費、成本增加，特別是夏季在部分氣溫較高地區(qū)無法進行正常生產(chǎn)。尋找耐高溫、合成胡蘿卜素能力弱化或者缺失的紅酵母將極大程度地克服上述缺點，提高工業(yè)化應(yīng)用潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一株耐高溫、高效產(chǎn)油且不產(chǎn)生色素的紅酵母u13n3及其培養(yǎng)方法以及在生產(chǎn)生物油脂中的應(yīng)用。發(fā)明人從一株馬鈴薯莖上分離篩選得到一株高產(chǎn)油脂的紅酵母(rhodotorulasp.)菌株。該紅酵母菌株在30℃的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-瓊脂(ypd)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，菌落呈近圓形，表面光滑有光澤，中部略隆起，邊緣整齊，菌落類白色。將菌落分散后在掃描電子顯微鏡下觀察，菌體呈卵圓形，多個菌體連接成長鏈。將菌落懸浮在生理鹽水中，長時間渦旋振蕩，菌體長鏈不易分散。發(fā)明人提取上述菌株的基因組dna(包含部分ssu，its1，5.8s，its2和部分lsu)，使用真菌通用引物its1和its4進行pcr擴增，將得到的pcr堿基序列(seqidno.1所示)在ncbi數(shù)據(jù)庫中進行同源序列分析，所得結(jié)果被鑒定為一株新的紅酵母，命名為紅酵母(rhodotorulasp.)u13n3。本發(fā)明的高產(chǎn)油脂的紅酵母(rhodotorulasp.)u13n3，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno：m2019503，保藏日期為2019年6月28日，保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)。本發(fā)明提供上述紅酵母的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：將紅酵母u13n3種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％～20％，于100～300rpm，ph3.5～7.5，20～42℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明還提供上述紅酵母在生產(chǎn)生物油脂中的應(yīng)用，包括以下步驟：步驟1，發(fā)酵培養(yǎng)：將紅酵母u13n3種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％～20％，于100～300rpm，ph3.5～7.5，20～42℃條件下培養(yǎng)，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；步驟2，油脂提?。簩l(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)離心或者過濾處理，收集紅酵母菌體，先用鹽酸溶液將濕的紅酵母菌體充分懸浮分散，再依次經(jīng)65℃和100℃水浴處理，得到細胞破碎液，然后加入氯仿-甲醇混合溶劑，充分振蕩并收集下層有機相，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑后，得到生物油脂。本發(fā)明所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源選自甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉中的一種或幾種，氮源選自蛋白胨、酵母粉、硝酸鹽和銨鹽中的一種或幾種。優(yōu)選地，步驟1中，所述的培養(yǎng)時間為3～10天。優(yōu)選地，步驟1中，所述的發(fā)酵溫度為35～37℃。優(yōu)選地，步驟1中，所述的發(fā)酵ph為4.5～6.5。優(yōu)選地，步驟2中，所述的氯仿-甲醇混合溶劑中，氯仿與甲醇的體積比為2:1。優(yōu)選地，步驟2中，所述的細胞破碎液與氯仿-甲醇混合溶劑的體積比為1:1。優(yōu)選地，步驟2中，采用6mol/l的鹽酸溶液將濕的紅酵母菌體充分懸浮分散，使得分散液中鹽酸的終濃度為4mol/l。優(yōu)選地，步驟2中，65℃水浴處理時間為30min，100℃水浴處理時間為10min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：(1)本發(fā)明的紅酵母u13n3顏色為類白色，而傳統(tǒng)紅酵母為紅色，與傳統(tǒng)紅酵母相比，紅酵母u13n3生產(chǎn)出的油脂色素含量顯著降低，降低了后處理難度，提高生物油脂品質(zhì)。(2)本發(fā)明的紅酵母u13n3環(huán)境適應(yīng)性好，在35～37℃培養(yǎng)生長迅速，不僅有利于降低生產(chǎn)水耗、電耗，提高生產(chǎn)效率，而且又能節(jié)約大量冷卻水的使用，保證了夏季的正常生產(chǎn)。(3)本發(fā)明的紅酵母u13n3能夠利用甘油等廉價碳源高產(chǎn)生物油脂，油脂含量可達菌體干重75％，生產(chǎn)效率高、成本低，具有產(chǎn)業(yè)化潛力。附圖說明圖1為紅酵母u13n3菌落形態(tài)圖；圖2為紅酵母u13n3菌體在掃描電子顯微鏡下的形態(tài)圖；圖3為根據(jù)基因序列同源性比對結(jié)果構(gòu)建的發(fā)育樹圖；圖4為從紅酵母u13n3發(fā)酵液中提取的生物油脂實物圖；圖5為從圓紅酵母cbs:6016發(fā)酵液中提取的生物油脂實物圖。具體實施方式下面結(jié)合實施例、對比例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明。下述實施例中，油脂提取參考文獻：【孔凡敏，趙祥穎，田延軍，等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[j].中國釀造，2010(5):143—146.】。實施例1發(fā)明人從一株馬鈴薯莖上分離篩選得到初始菌株。挑取生長在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-瓊脂(ypd)固體培養(yǎng)基上的單菌落，用生理鹽水稀釋涂布于新鮮ypd培養(yǎng)基，待生長出單菌落后，按照上述方法重新稀釋涂布。經(jīng)10次重復(fù)后，菌落與細胞形態(tài)保持一致，性狀穩(wěn)定。酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-瓊脂(ypd)固體培養(yǎng)基的組成為：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂粉。該菌株在30℃的ypd固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，菌落呈近圓形，表面光滑有光澤，中部略隆起，邊緣整齊，菌落類白色(圖1)。將菌落分散后在掃描電子顯微鏡下觀察，菌體呈卵圓形，多個菌體連接成長鏈(圖2)。將菌落懸浮在生理鹽水中，長時間渦旋振蕩，菌體長鏈不易分散。提取該菌株的基因組dna，采用引物：its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg3’；its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’，以基因組dna為模板進行pcr擴增。然后回收純化pcr產(chǎn)物，交由蘇州金唯智生物科技有限公司測序。測序得到有效序列長度為589bp，其序列如seqidno.1所示，測序結(jié)果與genbank中的its序列進行同源性比對，然后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。同源性分析結(jié)果表明，該序列與紅酵母屬真菌序列具有較高的相似度，與圓紅酵母模式菌cbs:6016(rhodotorulatoruloidescbs:6016)具有最高的序列相似度，達98％。結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件確定該菌株為紅酵母屬的一株新菌株，命名為紅酵母u13n3(rhodotorulasp.u13n3)。實施例2挑取1環(huán)生長在ypd固體培養(yǎng)基上的紅酵母u13n3單菌落接種到20ml含有種子培養(yǎng)基的100ml搖瓶中，25℃培養(yǎng)48h，搖瓶轉(zhuǎn)速100rpm，得到種子培養(yǎng)液。種子培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30g/l，k2hpo42g/l，酵母粉1.5g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，(nh4)2so41.2g/l，ph為4.5。取20ml種子液接種到含有80ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，接種量為10％，于100rpm，25℃條件下培養(yǎng)6d，得到發(fā)酵培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘油30g/l，k2hpo42g/l，酵母粉1.5g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，(nh4)2so41.2g/l，ph為6.5。將所得的發(fā)酵液經(jīng)離心處理，得到紅酵母菌體。然后加入6mol/l鹽酸至鹽酸終濃度為4mol/l，隨后65℃水浴處理30min，沸水浴處理10min，得到細胞破碎液。然后向該液體中加入等體積氯仿-甲醇(體積比2：1)混合液，充分振蕩、離心收集含有油脂的下層有機相。減壓蒸發(fā)除去有機溶劑后，回收剩余油脂(圖4)。稱重計算油脂在發(fā)酵液中濃度為5.8g/l。對比例1根據(jù)實施例2所述的方法，培養(yǎng)圓紅酵母cbs:6016(i.bannoq.m.wang,f.y.bai,m.groenew.&boekhout,2015)，從所得的發(fā)酵菌體中提取得到紅色油脂(圖5)。稱重計算油脂濃度為4.6g/l。所得產(chǎn)物感官和濃度均弱于紅酵母u13n3所得產(chǎn)物。實施例3根據(jù)實施例2的方法將紅酵母u13n3接種到種子培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24h，搖瓶轉(zhuǎn)速300rpm，得到種子培養(yǎng)液。種子培養(yǎng)基組成為：甘油30g/l，k2hpo42g/l，酵母粉1.5g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，(nh4)2so41.2g/l，ph為5.9。所得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％，于300rpm，37℃條件下培養(yǎng)9d，得到發(fā)酵培養(yǎng)液。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：甘油60g/l，k2hpo42g/l，酵母粉1.5g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，(nh4)2so41.2g/l，ph為5.6。所得的發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)固液分離，得到紅酵母菌體。用生理鹽水洗滌紅酵母菌體1次，并根據(jù)實施例2所述的方法提取油脂，最終得到淡黃色產(chǎn)物。經(jīng)計算油脂產(chǎn)量為19.8g/l，油脂含量為菌體干重的75.4％。序列表<110>南京理工大學(xué)<120>紅酵母及其培養(yǎng)方法和在生產(chǎn)生物油脂中的應(yīng)用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>589<212>dna<213>紅酵母(rhodotorula)<400>1cctgcggaaggatcattagtgaatattagggtgtccaacttaacttggagcccgaccctc60actttctaaccctgtgcatttgtcttgggtagtagcttgcgtcagcgagcgaatcccatt120tcacttacaaacacaaagtctatgaatgtaacaaatttataacaaacaaaactttcaaca180acggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgatacgtaatgtgaa240ttgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctccatggtattccgt300ggagcatgcctgtttgagtgtcatgaattcttcaacccacctctttcttagtgaatcagg360cggtgtttggattctgagcgctgctggcctcacggcctagctcgctcgtaatgcattagc420atccgcaatcgaacttcggattgactcggcgtaatagactattcgctgaggattctggtc480tctgactggagccgggtaagattaaaggaagctactaatcctcatgtctatcttgagatt540agacctcaaatcaggtaggactacccgctgaacttaagcatatcaataa589技術(shù)特征：1.高產(chǎn)油脂的紅酵母u13n3，保藏編號為cctccno：m2019503。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅酵母的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：將紅酵母u13n3種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％～20％，于100～300rpm，ph3.5～7.5，20～42℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源選自甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉中的一種或幾種，氮源選自蛋白胨、酵母粉、硝酸鹽和銨鹽中的一種或幾種。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅酵母在生產(chǎn)生物油脂中的應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟：步驟1，發(fā)酵培養(yǎng)：將紅酵母u13n3種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％～20％，于100～300rpm，ph3.5～7.5，20～42℃條件下培養(yǎng)，得到發(fā)酵培養(yǎng)液；步驟2，油脂提?。簩l(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)離心或者過濾處理，收集紅酵母菌體，先用鹽酸溶液將濕的紅酵母菌體充分懸浮分散，再依次經(jīng)65℃和100℃水浴處理，得到細胞破碎液，然后加入氯仿-甲醇混合溶劑，充分振蕩并收集下層有機相，減壓蒸發(fā)除去有機溶劑后，得到生物油脂。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟1中，所