分析化學(xué)中分第六章聯(lián)用技術(shù)第1頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.1 導(dǎo)言隨著生命科學(xué)、材料科學(xué)和環(huán)境科學(xué)等的發(fā)展和需求，復(fù)雜樣品體系的分離、分析已成為分析化學(xué)的重要研究方向和研究熱點(diǎn)之一。所謂復(fù)雜樣品體系，不僅僅是指樣品中的組分多樣性，而且還包含完全不同體系的物質(zhì)共存于一個(gè)樣品中。例如：無(wú)機(jī)與有機(jī)化合物共存一體，高分子、大分子與小分子化合物共存一體，生命與非生命物質(zhì)共存一體等。如果要對(duì)復(fù)雜樣品體系提供全面、準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)與成分表征信息，那么其分析過(guò)程可能包括從常量到微量、痕量分析，從成分到結(jié)構(gòu)、形態(tài)分析，從總體到微區(qū)、表面、空間分布分析，從宏觀形貌到微觀結(jié)構(gòu)分析，從靜態(tài)到動(dòng)態(tài)、時(shí)間分辨分析，從破壞到非破壞分析等等。因此，為了圓滿完成復(fù)雜樣品體系的全分析，需要綜合利用包括色譜法和質(zhì)譜法在內(nèi)的多種現(xiàn)代分離、分析方法。聯(lián)用技術(shù)的重要性和必要性！第2頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月本章在簡(jiǎn)介新質(zhì)譜方法的同時(shí)，也將介紹色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及接口技術(shù)的發(fā)展，還將介紹各種不同模式和類(lèi)型的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的實(shí)現(xiàn)、研究進(jìn)展及其在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用，以及其它聯(lián)用技術(shù)，如電化學(xué)－光譜，毛細(xì)管電泳－光譜聯(lián)用等。第3頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.2新質(zhì)譜法6.2.1質(zhì)譜學(xué)簡(jiǎn)介及其特點(diǎn)1906年J.J.Thomson發(fā)明了質(zhì)譜儀(Massspectroscopy,MS)，但直至1920s左右質(zhì)譜法才逐漸成為一種分析手段，被化學(xué)家采用。從1940s以后MS廣泛地應(yīng)用于有機(jī)物質(zhì)分析。1980s末期新軟電離技術(shù)的發(fā)明，能夠用于分析高極性、難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定樣品之后，生物質(zhì)譜才發(fā)展起來(lái)。常規(guī)質(zhì)譜分析儀的質(zhì)量范圍是幾十到2000da。生物質(zhì)譜(新質(zhì)譜法)是現(xiàn)代分析化學(xué)及相關(guān)生化研究的熱點(diǎn)之一和蛋白質(zhì)組學(xué)的主要手段。第4頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)譜法的特點(diǎn)：高靈敏度，可測(cè)10-8mol以下物質(zhì)的量；快速，數(shù)分鐘內(nèi)即可完成測(cè)試；能同時(shí)提供樣品的精確分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息；既可用于定性分析，也可用于定量分析；能有效地與各種色譜技術(shù)聯(lián)用，如GC/MS，

HPLC/MS，TLC/MS及CZE/MS等，用于復(fù)雜體系分析。MS的特點(diǎn)可概括為4個(gè)S:靈敏(sensitivity)、快速(speed)、專(zhuān)一(specificity)、化學(xué)計(jì)量(stoichiometry)。第5頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在過(guò)去的幾十年中，生物質(zhì)譜的主要進(jìn)展在于解決如何測(cè)定大質(zhì)量分子質(zhì)荷比m/z及其相關(guān)的問(wèn)題，主要的研究領(lǐng)域包括：如何擴(kuò)大質(zhì)譜儀器的質(zhì)量范圍？如何使生物大分子電離和使其帶多電荷(即降低m/z)？如何解釋大質(zhì)量分子質(zhì)譜？如何發(fā)展生物大分子質(zhì)譜測(cè)定方法？FredM.McLaffertyetal,Science,2006,314,109-112報(bào)道了采用MS可研究質(zhì)量大于200Kda的蛋白質(zhì)！第6頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月與質(zhì)譜相關(guān)而獲得諾貝爾獎(jiǎng)的有：J.J.Thomson(物理1906，發(fā)明質(zhì)譜技術(shù)并用于研究氣體的電導(dǎo))；F.W.Aston(化學(xué)1922，用質(zhì)譜儀發(fā)現(xiàn)了非放射性元素的同位素)；W.Paul(物理1980，發(fā)明離子阱質(zhì)譜原理與技術(shù))；R.F.Curl、R.E.Smalley和H.W.Kroto(化學(xué)1996，用質(zhì)譜儀觀察到激光轟擊下產(chǎn)生的C60)；K.Tanaka(田中耕一)和J.B.Fenn(化學(xué)2002，發(fā)明MALDI-MS和ESI-MS技術(shù))。第7頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物質(zhì)譜的最基本用途是能夠測(cè)量多肽/蛋白質(zhì)/核酸等生物大分子的分子質(zhì)量，并間接推測(cè)它的結(jié)構(gòu)及相互作用。1994年蛋白質(zhì)組學(xué)第一次被提出(MarcWilkins)，隨后生物質(zhì)譜被確認(rèn)為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的重要組成部分，認(rèn)識(shí)到生物質(zhì)譜另一吸引人之處是可以取代Edman降解測(cè)序方法，了解蛋白生成的早期結(jié)構(gòu)域，以及可以鑒定翻譯后修飾的能力。另外，生物質(zhì)譜還可以用來(lái)測(cè)定非共價(jià)鍵作用如抗體-抗原結(jié)合作用。2001以后，隨著基因組測(cè)序計(jì)劃的完成，蛋白質(zhì)組學(xué)的規(guī)?；殉啥ň?，生物質(zhì)譜正在發(fā)揮著不可取代的中堅(jiān)作用。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究之所以能夠蓬勃發(fā)展，主要依賴(lài)于高通量分離和分析技術(shù)的突破性進(jìn)展。首先是質(zhì)譜技術(shù)，尤其是軟電離技術(shù)的發(fā)展和雙向(二維)凝膠電泳技術(shù)的完善，使得蛋白質(zhì)的大范圍高通量分析成為可能。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)－生物質(zhì)譜！第8頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月Proteomicsisthestudyoftheproteome,theproteincomplementofthegenome.Theterms”proteomics”and“proteome”werecoinedbyMarcWilkinsandcolleaguesintheearly1990sandmirrortheterms“genomics”and“genome”,which

describetheentirecollectionofgenesinanorganism.IntroductiontoProteomics,DanielLiebler.2002,HumanaPress蛋白質(zhì)組學(xué)目前面臨的最大挑戰(zhàn)是什么？第9頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.2.2各種質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜儀的一般結(jié)構(gòu)框圖如圖6.1所示。質(zhì)譜分析是一個(gè)制備樣品或從其他分析儀器引入樣品樣品氣化并離子化引入樣品離子到分析器在分析器中按照離子的質(zhì)荷比不同分離離子分別檢測(cè)各種離子并得到質(zhì)譜圖的過(guò)程。圖6.1質(zhì)譜儀器組成示意圖第10頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)譜儀的核心是離子源和分析器，其他的部分一般根據(jù)離子源和分析器相應(yīng)地配備。離子源多種多樣，工作在真空狀態(tài)下的有：電子轟擊源(electronbombardment,EB)、化學(xué)離子源(chemicalIonization,CI)、真空火花源(sparksource,SS)、激光表面解析源(laserdesorption,LD)等；工作在低壓下的有輝光放電離子源(glowdischarge,GD)；工作在大氣壓下的有電(離子)噴霧(electron/ionspray,E/IS)、電感耦合等離子體源(inductivelycoupledplasma,ICP)等。第11頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分析器類(lèi)型主要有：磁偏轉(zhuǎn)、四極桿、離子阱、飛行時(shí)間、離子回旋共振等。不同的分析器與離子源之間有多種組合，構(gòu)成了質(zhì)譜儀器龐大的家族。二維質(zhì)譜：兩種不（相）同類(lèi)型的質(zhì)譜串聯(lián)在一起可形成二維質(zhì)譜。例如Q-TOFMS,QQ-TOFMS,TOF-TOFMS以及MSn等。二維質(zhì)譜在提高分析靈敏度、通量等方面具有特殊的優(yōu)點(diǎn)，是蛋白質(zhì)組大規(guī)模篩選的首選工具。第12頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.2.3大分子電離技術(shù)由于生物樣品的非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性及相對(duì)分子質(zhì)量大等特性，使傳統(tǒng)的電子轟擊(EI)、化學(xué)離子源(CI)等電離技術(shù)的應(yīng)用受到極大限制。隨著FAB、MALDI、ESI、ISI、大氣壓下碰撞電離(APCI)等電離技術(shù)的出現(xiàn)，大大提高了質(zhì)譜的測(cè)定范圍，改善了測(cè)量靈敏度，并在一定程度上解決了溶劑分子干擾等問(wèn)題，使質(zhì)譜在生物分析中的應(yīng)用得到進(jìn)一步的發(fā)展。表6.1生物質(zhì)譜電離技術(shù)比較第13頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目前用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離質(zhì)譜技術(shù)如下：電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizationmassspectrometry,

ESI-MS);(2)基體輔助激光解吸電離質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry,MALDI-MS)；(3)快原子轟擊質(zhì)譜(fastatombombardmentmassspectrometry,FAB-MS)；(4)離子噴霧電離質(zhì)譜(ionsprayionizationmassspectrometry,ISI-ISI-MS)；(5)大氣壓電離質(zhì)譜(atmosphericpressureionizationmassspectrometry,API-MS)；(6)解吸電噴霧電離質(zhì)譜(desorptionelectrosprayionizationmass spectrometry,DESI-MS)。第14頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.2.4基體輔助激光解吸電離MALDI離子源可以電離分子質(zhì)量為100-1000000Da的生物分子并用于質(zhì)譜分析，提供了高的靈敏度、高的離子透過(guò)率和強(qiáng)的可操作性。MALDI之所以得到發(fā)展，得益于早期試驗(yàn)用激光解吸及等離子體解吸生物有機(jī)分子的成功，也得益于FAB生物基質(zhì)的進(jìn)展。1990s在日本和德國(guó)幾乎同時(shí)報(bào)道了60000Da分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)的電離，引起全球的關(guān)注和興趣，并刺激了許多公司致力于開(kāi)發(fā)相關(guān)質(zhì)譜儀，并研究如何用MALDI技術(shù)分析蛋白質(zhì)、多肽及DNA。第15頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MALDI是1988年由Hillenkamp

和MichealKaras等首先提出的，其原理同F(xiàn)AB類(lèi)似。它利用激光束照射分散于基體中的樣品，由于這些基體（質(zhì)）能夠強(qiáng)烈吸收激光，從而保護(hù)了樣品分子。圖6.2MALDI技術(shù)原理示意圖第16頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月激光光束的能量首先被基體中的發(fā)色團(tuán)吸收，隨后這些基體迅速蒸發(fā)為氣相，被包含的樣品分子被帶入氣相，而離子化的產(chǎn)生是由于受激的基體分子將質(zhì)子轉(zhuǎn)移給樣品分子。這樣離子被引入質(zhì)量分析器，測(cè)量m/z得到質(zhì)譜圖，并提供其離子同位素的分布信息。MALDI-MS的實(shí)驗(yàn)參數(shù)包括：基體和基體/分析物，激光功率，波長(zhǎng)，脈沖寬度及記錄模式(正離子或負(fù)離子)。N2激光由于在UV段(337nm)有較好的性能，而被廣泛應(yīng)用于MALDI儀器中。第17頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MALDI中的基體起著如下幾種重要作用：（1）基體相當(dāng)于樣品分子的溶劑，樣品分子被基體彼此分開(kāi)，從而消弱了樣品之間的相互作用；（2）基體分子從脈沖激光中吸收足夠的能量，隔離樣品分子，提供光激發(fā)的酸或減基團(tuán)，以及在離子-分子碰撞中電離樣品分子。第18頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月選擇MALDI的基體主要要求如下：(1)對(duì)激光有高的吸收系數(shù)；(2)與樣品能夠溶于同一種溶劑中；(3)具有真空穩(wěn)定性；(4)對(duì)普遍存在于生物溶液中的無(wú)機(jī)鹽及緩沖液等污染物具有包容性。常用的基體有：芥子酸(SA)，2,5-二羥基苯甲酸，咖啡酸，吡臻酸，安息香酸，尼古丁酸等。第19頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MALDI-MS在基體選定后，準(zhǔn)備樣品的方法有兩種：Tanaka法：1987年

Tanaka等把待測(cè)的生物樣品溶于甘油中，并與很細(xì)的金屬粉末混合，然后把懸浮液滴到探頭上，讓激光照射，再進(jìn)入質(zhì)譜分析。靈敏度10-9mol數(shù)量級(jí)。(2)Hillenkamp法：1988年

Hillenkamp等認(rèn)為激光解吸時(shí)是底物吸收激光，提出了“基體輔助激光解吸”的概念。將煙酸和生物樣品混合溶液滴到探頭上，干燥后，用激光照射，即可得到生物分子離子信號(hào)。靈敏度10-12mol數(shù)量級(jí)，且信號(hào)強(qiáng)，信噪比高，被廣泛采用。問(wèn)題：為什么Tanaka獲得了Nobel化學(xué)獎(jiǎng)，而非Hillenkamp?第20頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MALDI的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)樣品要求低，能耐高濃度鹽、緩沖劑和其他非揮發(fā)性成分。高靈敏度，樣品量只需要1pmol，甚至更少。缺點(diǎn)：大質(zhì)量離子檢測(cè)較困難。離子型表面活性劑和低揮發(fā)性溶劑干擾嚴(yán)重，和其他進(jìn)樣技術(shù)聯(lián)用困難等。第21頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MALDI可以與不同類(lèi)型的檢測(cè)器相互結(jié)合，特別是飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF)，即MALDI-TOF質(zhì)譜！

圖6.3TheAgilentPulsedDynamicFocusingMALDI(PDF-MALDI)第22頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.4MALDI-TOF-MS的實(shí)際圖第23頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月MALDI-TOFMS中樣品離子化將TOF譜圖轉(zhuǎn)化為常規(guī)譜圖第24頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.5TheMALDI-TOFSpectraforPoly(PropyleneGlycol)第25頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月摘自：Anal.Chem.,2004,76,1532-1536.RichardB.vanBreemanetal圖6.6第26頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.2.5大氣壓電離質(zhì)譜方法API-MS指在大氣壓下使樣品有效地電離并引入與質(zhì)譜的接口，再進(jìn)行質(zhì)譜分析。API-MS的工作模式：(1)電噴霧(ESI)；(2)氣動(dòng)輔助電噴霧(又稱(chēng)離子噴霧,IS)；(3)大氣壓碰撞電離(APCI)；（4）解吸電噴霧電離質(zhì)譜(desorptionelectrosprayionizationMassspectrometry,DESI-MS)。API-MS可以測(cè)定的分子質(zhì)量范圍是100－100000Da，精度很容易達(dá)到飛克級(jí)至皮克級(jí)的絕對(duì)靈敏度，可適用的化合物的范圍非常廣泛?？膳c四極桿、離子阱、飛行時(shí)間質(zhì)譜等組合?？膳c許多進(jìn)樣技術(shù)兼容，如FIA,HPLC,CE等。第27頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月API-MS的四種工作模式的特點(diǎn)：電噴霧(ESI)：離子化過(guò)程應(yīng)用電場(chǎng)來(lái)產(chǎn)生帶電液滴，然后通過(guò)離子蒸發(fā)將分析物離子送入MS分析。氣動(dòng)輔助電噴霧：具有上述電噴霧的特點(diǎn)，但最初的液滴形成是由輔氣(如N2)幫助霧化的結(jié)果。大氣壓化學(xué)(碰撞)電離：利用一種氣態(tài)化學(xué)反應(yīng)，氣體溶劑

(如CH4)作為化學(xué)離子源來(lái)電離樣品。(4)解吸電噴霧電離DESI)：是在2004年所發(fā)展出來(lái)的新電離法。

利用探針產(chǎn)生帶電液滴，接著利用高速氮?dú)饬鞯臄y帶來(lái)撞擊

分析物表面，而從分析物表面所形成的離子再進(jìn)入質(zhì)譜儀

作分析。第28頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧的電離機(jī)理圖6.7電噴霧原理示意圖第29頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧的電離機(jī)理小分子離子蒸發(fā)機(jī)理：在噴針針頭與施加電壓的電極之間形成強(qiáng)電場(chǎng)該電場(chǎng)使液體帶電，帶電的液體在電場(chǎng)的作用下向帶相反電荷的電極運(yùn)動(dòng)，并形成帶電的液滴，由于小霧滴易分散，比表面增大，在電場(chǎng)中迅速蒸發(fā)，結(jié)果使帶電霧滴表面單位面積的場(chǎng)強(qiáng)度高達(dá)10x108V/cm2，從而產(chǎn)生液滴的“爆裂”。重

復(fù)該過(guò)程，最終產(chǎn)生分子離子。(2)大分子帶電殘基機(jī)理：首先也是電場(chǎng)使溶液帶電而離子化，結(jié)果形成帶電霧滴，帶電的霧滴在電場(chǎng)作用下運(yùn)動(dòng)并迅速去溶，溶液中分子所帶電荷在去溶時(shí)被保留在分子上，結(jié)果形成離子化的分子。第30頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ESI電離的一個(gè)主要特點(diǎn)是可以在大氣壓下蒸發(fā)樣品，離子化過(guò)程溫和，產(chǎn)生碎片極少，是一種軟電離方法。ESI通?？梢缘玫蕉嚯姾煞肿与x子，這對(duì)于測(cè)量大分子意義重大。由于大分子可以帶10－100以上電荷，因此，其質(zhì)荷比大大降低，可用普通質(zhì)量測(cè)定范圍的質(zhì)譜儀進(jìn)行生物大分子分析。第31頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.8電噴霧離子化過(guò)程示意圖第32頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月電噴霧的一般理論ESI放電電壓(V0)與表面張力(Ts)、毛細(xì)管半徑(r)及針尖與采樣板間距離(h)的關(guān)系可用下式表示：(6.1)在實(shí)驗(yàn)中雖然并不用它來(lái)進(jìn)行計(jì)算，但卻可以定性地幫助理解電噴霧的條件。第33頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ESI產(chǎn)生多電荷離子，在電離過(guò)程中，噴霧中顆粒帶電荷數(shù)q為：(6.2)式中：表示溶液的表面張力常數(shù)

o表示介電常數(shù)

rs表示液滴的半徑電噴霧離子一般每多1000相對(duì)分子質(zhì)量可以多帶一個(gè)電荷。第34頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月影響ESI過(guò)程的因素由于電噴霧過(guò)程非常復(fù)雜，影響因素有：離子化與否主要與被分析分子的pKa值和溶液的

pH有關(guān)；(2)噴霧狀態(tài)與表面張力和黏度有關(guān)，另外，與是否有氣動(dòng)輔助噴霧也有關(guān)(噴霧量較大時(shí))；(3)去溶好壞與干燥氣體的溫度和流量有關(guān)，并與溶劑的蒸發(fā)熱Hvap有關(guān)；(4)離子的解吸與它的溶解熱(氣態(tài))有關(guān)；(5)氣相反應(yīng)與質(zhì)子親和勢(shì)和電荷交換速度有關(guān)。第35頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ESI電離的優(yōu)點(diǎn)：被檢測(cè)分子變成氣相離子時(shí)沒(méi)有受到外部能量的激發(fā)，因而不會(huì)發(fā)生裂解，沒(méi)有碎片峰，因此譜圖解析相對(duì)簡(jiǎn)單；(2)對(duì)于多級(jí)質(zhì)譜，通過(guò)碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）可以產(chǎn)生碎片，從而提供分子的結(jié)構(gòu)信息。電噴霧質(zhì)譜不僅能夠產(chǎn)生多電荷離子、對(duì)某些極性物質(zhì)電離效率高（對(duì)蛋白質(zhì)接近100%），而且具有軟電離等特性，因而成為極性化合物（包括溶液中的離子），熱穩(wěn)定性差和高分子量化合物分析最有效的工具之一。(3)在常規(guī)電噴霧電離技術(shù)中，噴霧過(guò)程容易形成較大液滴，液滴中的樣品分子不能完全離子化，因而降低了樣品的利用率和質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。近幾年發(fā)展起來(lái)的納升電噴霧方法

(Nanospray)，采用內(nèi)徑為10μm左右的噴針，樣品注入到噴針的噴口，在噴口前端產(chǎn)生噴霧，噴霧液滴比常規(guī)電噴霧產(chǎn)生的小100倍，這樣可以使樣品被充分利用，并有效離子化。與常規(guī)電噴霧電離技術(shù)相比，Nanospray流量極低，樣品消耗量極少，靈敏度可以達(dá)到fmol。第36頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.9電噴霧質(zhì)譜儀第37頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.10典型的電噴霧質(zhì)譜圖第38頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.3 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用作為化學(xué)領(lǐng)域最強(qiáng)有力的分離分析技術(shù)之一，自上世紀(jì)70年代以來(lái)，液相色譜(LC)，特別是高效液相色譜（HPLC）得到了迅速的發(fā)展，無(wú)論在色譜基礎(chǔ)理論，還是在儀器性能方面都得到了很大程度的提高和完善。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，LC在環(huán)境分析、生化分析、醫(yī)藥分析和藥物質(zhì)量控制等方面的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，尤其是隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，LC已經(jīng)成為一種極為重要和必不可少的分離分析手段。LC雖然在復(fù)雜樣品分析中顯示出很高的分離效率，而且定量準(zhǔn)確，但其定性分析能力卻較為薄弱，通常僅僅是根據(jù)各組分的保留特性來(lái)定性，這在復(fù)雜樣品分析中，尤其在未知組分的定性分析中具有一定的難度（可信度差和無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品）。6.3.1概述第39頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月然而，隨著一些新的定性分析手段的出現(xiàn)，尤其是質(zhì)譜儀器的發(fā)展，對(duì)一些組分相對(duì)簡(jiǎn)單的樣品進(jìn)行定性分析已經(jīng)變得比較容易。質(zhì)量是物質(zhì)的固有特征之一，質(zhì)譜分析中，表現(xiàn)為不同荷質(zhì)比的化合物對(duì)應(yīng)不同的離子譜峰，由此，根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果可以獲得被分析物的分子量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行定性分析，另外，離子譜峰的強(qiáng)度與其所代表的化合物含量有一定關(guān)系，所以，利用這一點(diǎn)可以對(duì)各物質(zhì)進(jìn)行半定量分析。質(zhì)譜分析雖然具有靈敏度高、鑒別能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但是由于離子抑制效應(yīng)等的影響在復(fù)雜樣品定性分析中卻具有一定困難。由此可以看出，如果把LC分離和質(zhì)譜分析有機(jī)結(jié)合起來(lái)，充分發(fā)揮它們各自的優(yōu)點(diǎn)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，就可以有效的對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行定性和定量分析，因此，LC

-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)逐漸被廣大科研工作者所關(guān)注。第40頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的研究始于20世紀(jì)70年代，90年代以后，由于大氣壓電離技術(shù)的出現(xiàn)和成功應(yīng)用以及質(zhì)譜本身的發(fā)展，液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用得到了極大的重視和發(fā)展。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)將液相色譜的高分離效能和質(zhì)譜的高靈敏度及較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)解析能力有機(jī)的結(jié)合在一起，樣品經(jīng)過(guò)液相色譜分離后，借助質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行鑒定，開(kāi)辟了復(fù)雜樣品分離和檢測(cè)的新天地。第41頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS，TandemMS,MSn）技術(shù)是質(zhì)譜分析中的重要聯(lián)用技術(shù)，不僅可以給出樣品分子量的相關(guān)信息，而且還可以給出有關(guān)樣品結(jié)構(gòu)的豐富信息。串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)包括三個(gè)過(guò)程：即用來(lái)進(jìn)行質(zhì)量分離的第一級(jí)質(zhì)譜（MS1），碰撞活化離解和用來(lái)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)的第二級(jí)質(zhì)譜（MS2）。其中碰撞活化離解是使運(yùn)動(dòng)中的離子和中性惰性氣體進(jìn)行碰撞、繼而發(fā)生碰撞活化離解的過(guò)程。第42頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月另外，液相色譜與單級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）雖然已經(jīng)具有足夠高的靈敏度，但是僅能提供分子量信息，而液相色譜與多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）則可提供分子結(jié)構(gòu)的信息，此外，通過(guò)MS/MS的選擇反應(yīng)控制模式(SRM)或多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)可以提高信噪比，在復(fù)雜樣品分析時(shí)仍可達(dá)到很高的靈敏度。第43頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.3.2液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用接口技術(shù)例如HPLC與MS接口的主要問(wèn)題（1）HPLC流出物如果全部氣化，可產(chǎn)生500－1000mL/min的氣體，而MS采樣僅能接受10－50mL/min的氣體；（2）通用的氣相電離方法一般不適用于HPLC分離后的化合物（具有熱不穩(wěn)定性、極性和較高分子量）。為實(shí)現(xiàn)液相色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用，需要解決液相色譜流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜工作條件的影響的問(wèn)題，為此可以通過(guò)以下兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：一是發(fā)展不同接口以協(xié)調(diào)LC和MS的不同要求；二是改進(jìn)液相色譜技術(shù)，如發(fā)展微柱液相色譜，減少進(jìn)入質(zhì)譜流動(dòng)相的量，改進(jìn)質(zhì)譜的離子化方法，使它們兩者之間逐漸靠近。第44頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的實(shí)現(xiàn)，接口技術(shù)一度成為其發(fā)展的瓶頸。在接口研制方面，前后共發(fā)展了20多種技術(shù)，其中主要有直接導(dǎo)入接口（DLI）、移動(dòng)帶接口（MB）、熱噴霧接口（ES）、粒子束接口（PB）、和快原子轟擊（FAB）等，但這些技術(shù)都不同程度的存在一些方面的限制和缺陷。近幾年來(lái)，隨著一系列質(zhì)譜軟電離技術(shù)的實(shí)現(xiàn)和發(fā)展，尤其是隨著大氣壓離子化接口(API)技術(shù)和基體輔助激光解吸離子化接口（MALDI）技術(shù)的不斷成熟和完善，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不僅得到了突破性的進(jìn)展，而且在生命科學(xué)中的應(yīng)用也得到了前所未有的拓展。第45頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月理想的LC-MS接口應(yīng)具有如下的特點(diǎn)：（1）高效率的樣品轉(zhuǎn)移，可接受的樣品轉(zhuǎn)移精度；（2）可適應(yīng)不同的LC方法；（3）可適應(yīng)不同的質(zhì)譜操作條件；（4）樣品在轉(zhuǎn)移過(guò)程中不被分解損失；（5）高速、方便可靠，對(duì)操作人員的技術(shù)要求不高。第46頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.3.2.1大氣壓離子化接口技術(shù)

大氣壓離子化接口是指離子化在常壓下進(jìn)行的接口，是目前液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)中應(yīng)用范圍最廣的一種接口。API主要包括電噴霧電離（ESI）和大氣壓化學(xué)電離（APCI）兩種操作模式。。

第47頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月該電離技術(shù)利用位于一根毛細(xì)管和質(zhì)譜儀進(jìn)口間的電勢(shì)差生成離子，在電場(chǎng)的作用下產(chǎn)生以噴霧形式存在的帶電液滴，當(dāng)使用干燥氣體或者加熱時(shí)，溶劑蒸發(fā)，帶電液滴體積縮小，電場(chǎng)增強(qiáng)，離子向液滴表面移動(dòng)并從表面揮發(fā)，最終生成單電荷或多電荷去溶劑化離子。通常情況下，小分子生成[M+H]+或[M-H]-單電荷離子，生物大分子產(chǎn)生多電荷離子。

圖6.11電噴霧電離接口示意圖第48頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.12大氣壓化學(xué)電離接口示意圖是將化學(xué)電離原理延伸到大氣壓下進(jìn)行的一種新的軟電離技術(shù)。樣品溶液從LC流出，進(jìn)入具有霧化氣套管的毛細(xì)管后，被氮?dú)饬黛F化，然后在通過(guò)加熱管時(shí)被氣化，氣化后的溶劑分子在加熱管端的電暈放電探針處形成反應(yīng)氣等離子體，樣品分子通過(guò)與反應(yīng)氣等離子體進(jìn)行質(zhì)子交換被電離，形成準(zhǔn)分子離子[M+H]+或[M-H]-，最后，樣品分子的準(zhǔn)分子離子通過(guò)篩選狹縫進(jìn)入質(zhì)譜儀，整個(gè)過(guò)程在大氣壓條件下完成。第49頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月APCI（大氣壓化學(xué)電離）也是一種軟電離接口技術(shù)，電離過(guò)程中只產(chǎn)生單電荷峰，非常適合弱極性小分子化合物的測(cè)定，另外，APCI還與高流量的梯度洗脫和高低水溶液變換的流動(dòng)相兼容，通過(guò)調(diào)節(jié)離子源電壓，可以得到不同斷裂程度的質(zhì)譜圖。第50頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月無(wú)套流CE-ESI接口nLC-ESI接口Z－噴霧ESI源第51頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.13直接將CE與ESI-MS連接的接口設(shè)計(jì)第52頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.3.2.2LC與MALDI接口技術(shù)LC與MALDI的聯(lián)用目前正在發(fā)展中，從離子化的原理看，存在一些實(shí)際困難！第53頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月作為分離科學(xué)領(lǐng)域中最強(qiáng)有力的分離分析工具之一，液相色譜對(duì)組分相對(duì)簡(jiǎn)單樣品的分離采用一維分離模式完成，但是對(duì)于一些組分復(fù)雜的樣品而言，如果僅采用一維色譜分離模式，無(wú)論怎樣優(yōu)化色譜分離條件，也無(wú)法使所有的組分都能達(dá)到滿意的分離。Davis等曾經(jīng)指出:只用一維分離方法對(duì)含有100個(gè)隨機(jī)分布組分的樣品進(jìn)行分離，完全分離其中的82個(gè)組分大約需要四百萬(wàn)理論塔板數(shù)。顯然，期望具有如此之高柱效的色譜柱在目前看來(lái)是不切合實(shí)際的。而與一維色譜相比，近幾年來(lái)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的多維液相色譜(Multidimensionalhigh-performanceliquidchromatography，MDLC)不僅能夠提供更大的峰容量，而且還具有分離樣品動(dòng)態(tài)范圍寬、分辨率高和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，它的出現(xiàn)不僅很好的解決了復(fù)雜樣品的分離分析問(wèn)題，而且大大提高了液相色譜的分離能力和選擇性。因此，多維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用也越來(lái)越被重視并得到迅速發(fā)展，所以，根據(jù)聯(lián)用體系中液相色譜的維數(shù)多少，液相色譜-質(zhì)譜在線聯(lián)用技術(shù)又可以分為一維液相色譜-質(zhì)譜在線聯(lián)用模式和多維液相色譜-質(zhì)譜在線聯(lián)用模式。第54頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.14多維液相色譜分離模式2D-SEC-RPLC-MS;(b)多維蛋白質(zhì)識(shí)別技術(shù)SEC－尺寸排阻色譜RPLC－反相色譜第55頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.15全二維液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用裝置原理示意圖

第56頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.16川芎甲醇提取液的二維分離色譜圖

第57頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.4 電化學(xué)－光譜聯(lián)用電化學(xué)技術(shù)主要涉及電流、電勢(shì)和電量的變化，在工農(nóng)業(yè)和日常生活中發(fā)揮重要作用(葡萄糖傳感器和各種電池)，但采用電化學(xué)技術(shù)很難得到物質(zhì)結(jié)構(gòu)方面的信息。因此，有必要將電化學(xué)技術(shù)和其他方法進(jìn)行聯(lián)用。與電化學(xué)技術(shù)聯(lián)用的方法最常見(jiàn)的是各種光譜學(xué)技術(shù)。這些技術(shù)分為現(xiàn)場(chǎng)(insitu)和非現(xiàn)場(chǎng)(exsitu)方法?，F(xiàn)場(chǎng)方法是在控制電勢(shì)或電流時(shí)考察電解池溶液中的電極表面；在采用非現(xiàn)場(chǎng)技術(shù)時(shí)，電極是從電化學(xué)池中拿走，然后進(jìn)行測(cè)量，經(jīng)常是在空氣或真空中進(jìn)行。在此主要討論現(xiàn)場(chǎng)方法。第58頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.4.1與紫外和可見(jiàn)光譜聯(lián)用圖6.17透射光譜電化學(xué)實(shí)驗(yàn)裝置示意圖光透電極(opticallytransparentelectrode,OTE)A透射實(shí)驗(yàn)第59頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.18(a)用于半無(wú)限擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)的透射光譜電化學(xué)池。光束從垂直方向通過(guò)；(b)光透薄層體系：正視和側(cè)視圖。第60頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.19采用在SnO2OTE電極上產(chǎn)生甲基紫精自由基的電量滴定細(xì)胞色素c和細(xì)胞色素c氧化酶。在溶液中，一個(gè)甲基紫精自由基可還原細(xì)胞色素c中的一個(gè)血紅素或細(xì)胞色素c氧化酶中的兩個(gè)血紅素中的一個(gè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞色素c氧化酶中的一個(gè)血紅素基團(tuán)首先被還原，然后甲基紫精自由基在還原細(xì)胞色素c氧化酶中的第二個(gè)血紅素之前，還原細(xì)胞色素c中的血紅素。第61頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月6.4.2與振動(dòng)光譜的聯(lián)用A紅外光譜在紅外光譜電化學(xué)(infraredspectroelectrochemistry,IR-SEC)中，被探測(cè)物質(zhì)在電極表面和距電極表面很薄的溶液層中。常用的外反射模式如圖6.20所示。IR輻射窗口薄溶液層圖6.20紅外光譜電化學(xué)的外反射示意圖第62頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.21IR-SEC的光譜電化學(xué)池第63頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月由于大多數(shù)溶劑對(duì)紅外輻射有較強(qiáng)的吸收，所以窗口和電極之間的溶液薄層必須很小(1-100nm)。為了得到有用的信號(hào)，通常采用對(duì)電勢(shì)或入射光進(jìn)行調(diào)制。電勢(shì)調(diào)制紅外技術(shù)稱(chēng)為EMIRS，即電化學(xué)調(diào)制紅外反射光譜法(electrochemicallymodulatedinfraredspectroscopy)。

圖6.22EMIRS實(shí)驗(yàn)的儀器方框圖振蕩器改變電極電勢(shì)，并且為相敏檢測(cè)器(PDS)提供一個(gè)參比信號(hào)。檢測(cè)器調(diào)制的IR信號(hào)也反饋到PDS。第64頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月大多數(shù)現(xiàn)代IR光譜儀具備Fourier變換的多種優(yōu)點(diǎn)。相應(yīng)的IR-SEC技術(shù)是SNIFTIRS，即差減歸一化界面Fourier變換紅外光譜法(SubstractivelynormalizedinterfacialFouriertransforminfraredspectroscopy)。

圖6.23SNIFTIRS儀器的方框圖光源、干涉儀、檢測(cè)器和數(shù)據(jù)存取通常與一個(gè)商品化的FTIR儀器相同[引自J.K.Foley,C.Korzeniewski,J.L.DaschbachandS.Pons,Electroanal.Chem.,14,309(1986)]第65頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月圖6.24在不同的波數(shù)區(qū)域和在1mol/LHClO4溶液中對(duì)-二氯苯在Pt電極上的SNIFTIRS光譜圖。每條曲線是在0.2V和0.4V(相對(duì)于NHE)處記錄的光譜的差值。負(fù)峰相應(yīng)于在0.4V處的特征主峰，正峰相應(yīng)于在0.2V處的特征主峰。第66頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月B拉曼光譜拉曼光譜提供與IR光譜互補(bǔ)的分子振動(dòng)信息。由于激發(fā)和測(cè)量均在可見(jiàn)光區(qū)，電化學(xué)池可采用玻璃窗和水溶液(兩者均對(duì)紅外有強(qiáng)吸收)。拉曼散射的概率取決于一些確定的選擇規(guī)律，但在大多數(shù)情況下是很低的，因此實(shí)驗(yàn)必須采用強(qiáng)光源和較高的樣品濃度。圖6.25具有激光激發(fā)和電荷偶合裝置(charge-coupleddevice,CCD)作為檢測(cè)器的Raman光譜儀的方框圖。第67頁(yè)，課件共82頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月當(dāng)分子吸附在特定的表面(例如銀或金)時(shí)，拉曼效應(yīng)可以得到很大的增強(qiáng)，據(jù)此所發(fā)展的方法稱(chēng)為表面增強(qiáng)拉曼光譜法(surfaceenhancedRamanspectroscopy,SERS)。SERS的Raman信號(hào)增強(qiáng)105－106倍。圖6.26在波長(zhǎng)514.5nm激光激發(fā)下，在三種不同波長(zhǎng)區(qū)內(nèi)測(cè)得的吸附在Ag電極上的Os(NH3)5py3+的SERS光譜與電勢(shì)(尺度標(biāo)在右側(cè))關(guān)系圖第68頁(yè)，課件共82頁(yè)