第七章層析分離技術(shù)（7）第七章層析分離技術(shù)（7）1本章內(nèi)容7.1層析技術(shù)導(dǎo)論

7.2凝膠過濾層析7.3離子交換層析7.4親和層析7.5固定金屬離子親和層析7.6疏水作用層析7.7反相層析本章內(nèi)容7.1層析技術(shù)導(dǎo)論27.7反相層析一、基本原理二、反相介質(zhì)的種類三、特點(diǎn)及用途四、影響因素五、高效液相色譜簡(jiǎn)介7.7反相層析一、基本原理37.7反相層析

一、基本原理反相層析（Reversed-phasechromatography,RPC）利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相，是根據(jù)溶質(zhì)極性（疏水性）的差異進(jìn)行分離純化的層析技術(shù)。反相層析屬于分配層析，溶質(zhì)在固定相（非極性介質(zhì)）和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性：溶質(zhì)的疏水性越大，其在固定相中的分配系數(shù)越大。烴類化合物的分配系數(shù)與其分子所含碳原子數(shù)成正比。當(dāng)固定相一定時(shí)，可通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成來調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。流動(dòng)相的極性越大，溶質(zhì)的分配系數(shù)越大。因此，RPC多采用降低流動(dòng)相極性（水含量）的線性梯度洗脫法。7.7反相層析

一、基本原理反相層析（Reversed-p47.7反相層析

二、反相介質(zhì)的種類反相介質(zhì)的商品種類繁多，其中最具代表性的是以硅膠為載體，通過硅烷化反應(yīng)在硅膠表面鍵和非極性分子層。硅烷化反應(yīng)式如下：其中，硅烷化試劑中R1和R2多為甲基，R為C4、C8、C18烷基或苯基，一般簡(jiǎn)稱為C4、C8、C18柱等另外，高分子聚合物也可作為反相介質(zhì)，如：聚丙烯酸酯-C187.7反相層析

二、反相介質(zhì)的種類反相介質(zhì)的商品種類繁多，57.7反相層析

三、特點(diǎn)及用途一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。為了得到更好的分離效果，有時(shí)加入一定濃度的三氟乙酸（TFA）適用于分離非極性和極性較弱的化合物。RPC主要用于相對(duì)分子質(zhì)量低于5000，特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化，也可用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析與純化。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性，并且流動(dòng)相為低極性的有機(jī)溶劑，生物大分子在RPC過程中容易變性失活。因此，以回收生物活性蛋白為目的時(shí)，應(yīng)注意選擇適宜的反相介質(zhì)和流動(dòng)相。隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會(huì)使硅膠溶解，太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右。7.7反相層析

三、特點(diǎn)及用途一般用非極性固定相（如C1867.7反相層析

三、特點(diǎn)及用途相似之處：均是利用不同物質(zhì)與固定相之間的疏水性作用力不同進(jìn)行色譜分離。不同之處：①固定相的疏水程度不同；②流動(dòng)相組成不同；③操作方式不同；④應(yīng)用范圍不同。反相色譜與疏水作用色譜的比較7.7反相層析

三、特點(diǎn)及用途相似之處：反相色譜與疏水作用77.7反相層析

四、反相層析的影響因素在反相介質(zhì)已經(jīng)確定的情況下，影響反相層析分辨率的因素主要包括：流動(dòng)相的組成、洗脫模式、層析柱尺寸、流速、溫度等。1.流動(dòng)相2.洗脫模式3.層析柱的尺寸4.流速5.溫度7.7反相層析

四、反相層析的影響因素在反相介質(zhì)已經(jīng)確定的81.流動(dòng)相1)流動(dòng)相的組成：流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑可降低流動(dòng)相的極性，流動(dòng)相極性越低，其洗脫能力越強(qiáng)，因此洗脫時(shí)通常采用的有機(jī)溶劑比例會(huì)逐漸提高，以使各樣品組分按疏水性由弱到強(qiáng)的順序洗脫；對(duì)有機(jī)溶劑的要求：與水互溶、由較低的紫外吸收及較低黏度（如乙腈、甲醇、乙醇等）。2）流動(dòng)相的pH值：反相層析的流動(dòng)相條件多在低pH值下（pH2-4）層析介質(zhì)（如硅膠）在高pH下不穩(wěn)定；很多組分在低pH下具有較好的溶解性；低pH抑制了樣品組分中酸性基團(tuán)及硅膠上硅醇基的解離；為了使流動(dòng)相保持在低pH下，在流動(dòng)相中加入酸（如三氟乙酸（TFA））。1.流動(dòng)相1)流動(dòng)相的組成：流動(dòng)相中的有機(jī)溶劑可降低流動(dòng)相92.洗脫模式由于溶質(zhì)中不同組分的疏水性強(qiáng)弱不同，與固定相結(jié)合的牢固程度不同，在起始條件下，極性很強(qiáng)的組分不能結(jié)合在固定相上面直接被洗脫，其余組分結(jié)合在固定相表面，為了將這些組分洗脫下來，必須降低流動(dòng)相的極性，即增加流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例。因此，反相層析的洗脫過程中流動(dòng)相的組成隨時(shí)間而變化。通?？刹捎秒A段洗脫和梯度洗脫。最理想的洗脫條件是通過多次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后得到的。2.洗脫模式由于溶質(zhì)中不同組分的疏水性強(qiáng)弱不同，與固定相結(jié)103.層析柱的尺寸層析柱的尺寸由其內(nèi)徑和柱長(zhǎng)所決定，內(nèi)徑影響層析的規(guī)模，但對(duì)分辨率沒有影響，柱長(zhǎng)對(duì)分辨率的影響則與溶質(zhì)的種類有關(guān)。對(duì)于小分子有機(jī)物，增加柱長(zhǎng)可以提高柱效改善分辨率，而多肽、核酸等生物大分子對(duì)柱長(zhǎng)的敏感程度較低。3.層析柱的尺寸層析柱的尺寸由其內(nèi)徑和柱長(zhǎng)所決定，114.流速流速對(duì)于反相層析的影響是多方面的，一般來說，流速對(duì)于小分子的分離影響較大而大分子對(duì)流速變化敏感性較低。通常過高的流速會(huì)導(dǎo)致渦流擴(kuò)散嚴(yán)重，影響樣品在固定相和流動(dòng)相之間的平衡，導(dǎo)致洗脫峰寬度變大分辨率下降；但過低的流速可能會(huì)導(dǎo)致樣品組分縱向擴(kuò)散加劇，也會(huì)使分辨率下降，且分離時(shí)間較長(zhǎng)，不利于樣品的穩(wěn)定和較大規(guī)模的分離；4.流速流速對(duì)于反相層析的影響是多方面的，一般來說，流速對(duì)125.溫度溫度對(duì)于反相層析的分離結(jié)果有較大的影響。提高溫度能夠降低流動(dòng)相的黏度，增加傳質(zhì)速度，減少區(qū)帶變寬現(xiàn)象，從而改善分辨率。但是在分離生物大分子的時(shí)候必須考慮到分子的穩(wěn)定性，因此不宜用太高的溫度。5.溫度溫度對(duì)于反相層析的分離結(jié)果有較大的影響。137.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介1.基本原理2.特點(diǎn)3.應(yīng)用4.高效液相色譜儀的組成5.HPLC在蛋白分離中的應(yīng)用及操作規(guī)程6.HPLC-RPC在蛋白分離中的應(yīng)用舉例7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介1.基本原理147.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜（HighPerformanceLiquidChromatography,HPLC）與經(jīng)典的色譜法（或?qū)游龇ǎ┑姆蛛x機(jī)制類似——混合物在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，在兩相中作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程,各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別,被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出。1.基本原理7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介高效液相色譜（High157.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC在經(jīng)典液相色譜的基礎(chǔ)上，采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度的檢測(cè)器，具有高分辨率、高靈敏度、速度快、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。3.應(yīng)用HPLC被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向。

2.特點(diǎn)7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介HPLC在經(jīng)典液相色譜167.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介（1）高壓輸送系統(tǒng)（2）進(jìn)樣系統(tǒng)（3）分離系統(tǒng)（4）檢測(cè)系統(tǒng)及記錄系統(tǒng)4.高效液相色譜儀的組成7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介（1）高壓輸送系統(tǒng)4.177.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介溶劑貯存器：貯存流動(dòng)相（1~2L）高壓泵：將貯存器中的流動(dòng)相連續(xù)送入色譜系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。壓力：0~42MPa，流速：0.001~10ml/min。梯度洗脫裝置：通過程序控制混合泵來使流動(dòng)性的離子強(qiáng)度/pH/極性等發(fā)生梯度變化，提高分離效果和效率。4.高效液相色譜儀的組成——（1）高壓輸送系統(tǒng)7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介溶劑貯存器：貯存流動(dòng)187.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介六通閥進(jìn)樣器是高效液相色譜系統(tǒng)中最理想的進(jìn)樣器，它是由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成。

工作原理：

①手柄裝載(Load)位置時(shí)，樣品經(jīng)微量進(jìn)樣針從進(jìn)樣孔注射進(jìn)定量環(huán)，定量環(huán)充滿后，多余樣品從放空孔排出；

②將手柄轉(zhuǎn)動(dòng)至進(jìn)樣(Inject)位置時(shí)，閥與液相流路接通，由泵輸送的流動(dòng)相沖洗定量環(huán)，推動(dòng)樣品進(jìn)入液相分析柱進(jìn)行分析。4.高效液相色譜儀的組成——（2）進(jìn)樣系統(tǒng)LoadInject7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介六通閥進(jìn)樣器是高效液相197.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介柱管（柱殼）材質(zhì)：玻璃柱、不銹鋼柱柱長(zhǎng)及柱內(nèi)徑：4.6mm×150mm/4.6mm×250mm（分析柱）柱內(nèi)經(jīng)>25mm（制備柱）固定相（填料）類型：凝膠柱、離子交換柱、親和柱和反相柱?？讖剑焊鶕?jù)樣品分子量大小選擇填料的孔徑。分子量越小，孔徑要求也越小；反之亦然。粒徑：5μm（標(biāo)準(zhǔn)），3.0μm/3.5μm（短柱）4.高效液相色譜儀的組成——（3）分離系統(tǒng)7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介柱管（柱殼）4.高效液207.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介檢測(cè)器：類型：紫外、熒光、電導(dǎo)、pH等檢測(cè)器。性能要求：靈敏度高、噪音低、線性范圍寬、響應(yīng)快及對(duì)溫度和流速不敏感等。記錄系統(tǒng)：樣品被分離成單個(gè)組分后，依次從柱內(nèi)流出,通過檢測(cè)器時(shí),樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來或在電腦上顯示。4.高效液相色譜儀的組成——（4）檢測(cè)系統(tǒng)及記錄系統(tǒng)7.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介檢測(cè)器：4.高效液相色217.7反相層析

五、高效液相色譜簡(jiǎn)介（1）色譜柱的選擇：根據(jù)被分離蛋白的性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x模式和不同規(guī)格和性能色譜柱。凝膠色譜反相色譜（2）樣品液的準(zhǔn)備：將分析樣品轉(zhuǎn)化為適合HPLC直接進(jìn)樣的樣品。樣品制備步驟：取材→勻漿→預(yù)分離→濃縮→溶解保持蛋白活性的措施：低溫操作、添加蛋白酶抑制劑等提高蛋白溶解性的措施：適當(dāng)加入表面活性劑、變性劑等在進(jìn)樣之前最好用0.45μm/0.22μm膜過濾。（3）流動(dòng)相的選擇：合適的極性、良好的選擇性、與檢測(cè)器匹配。pH的選擇：梯度洗脫條件的選擇有機(jī)改良劑的加入：三氟乙酸（TFA）流動(dòng)相的配制：互溶性、微孔膜過濾5.HPL