PAGE實(shí)驗(yàn)八培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的要求掌握微生物實(shí)驗(yàn)室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。掌握培養(yǎng)基的配置方法。掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性．因而用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同．例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無(wú)菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。三、實(shí)驗(yàn)材料藥品：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1．玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來(lái)水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來(lái)水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2．滅菌前玻璃器皿的包裝培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套，可用報(bào)紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。圖8-1移液管的包扎移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長(zhǎng)度約1~1.5cm。塞棉花時(shí)．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時(shí)以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。圖8-1移液管的包扎先將報(bào)紙裁成寬約5cm左右的長(zhǎng)紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長(zhǎng)條報(bào)紙的一端，約成45℃角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來(lái)。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過(guò)程1．液體培養(yǎng)基配制稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計(jì)算出各成分的用量．然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來(lái)水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動(dòng)，加熱溶解。定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用pH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH為止。過(guò)濾：用濾紙或多層紗布過(guò)濾培養(yǎng)基。一般無(wú)特殊要求時(shí)，此步可省去。2．固體培養(yǎng)基的配制配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1.5~2％)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。（三）培養(yǎng)基的分裝根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1．試管的分裝取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開(kāi)放彈簧夾，中指及無(wú)名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜。2．三角瓶的分裝圖8-2培養(yǎng)基的分裝用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250m1三角瓶中加入50m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作圖8-2培養(yǎng)基的分裝平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按2％計(jì)算)，滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)通入試管或三角瓶?jī)?nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過(guò)濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1．試管棉塞的制作制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔堆積時(shí)要留有空隙，物品不要擺放得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電熱干燥箱內(nèi)壁的鐵板、溫度探頭，以防包裝紙烤焦起火。升溫：接通電源，打開(kāi)開(kāi)關(guān)，適當(dāng)打開(kāi)電熱干燥箱頂部的排氣孔，旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器，使溫度逐步上升。當(dāng)溫度升至100℃時(shí)，關(guān)閉排氣孔。在升溫過(guò)程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示電熱干燥箱內(nèi)停止加溫，此時(shí)如果還未達(dá)到所需的160℃~170℃，則需要轉(zhuǎn)動(dòng)溫度調(diào)節(jié)器使紅燈亮，如此反復(fù)調(diào)節(jié)，直至達(dá)到所需的溫度。恒溫：當(dāng)溫度升到160℃~170℃時(shí)，借助恒溫調(diào)節(jié)器的自動(dòng)控制，保持此溫度2h。干熱滅菌過(guò)程中，嚴(yán)防恒溫調(diào)節(jié)的自動(dòng)控制失靈而造成安全事故。降溫：切斷電源，自然降溫。開(kāi)箱取物：待電熱干燥箱內(nèi)溫度降到60℃以下后，才能打開(kāi)箱門(mén)，取出滅菌物品。同時(shí)，應(yīng)將溫度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到零點(diǎn)，并打開(kāi)排氣孔。電熱干燥箱內(nèi)溫度未降到60℃以前，切勿自行打開(kāi)箱門(mén)，以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。（二）高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，在一定的壓力下保持15~30分鐘進(jìn)行滅菌。此法適用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水、工作服等物品的滅菌，也可用于玻璃器皿的滅菌。將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋夾套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中排盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，獲得高于100℃的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在相同的溫度下，濕熱滅菌的效果好于干熱滅菌。有三點(diǎn)原因：在濕熱滅菌中菌體吸收水分，蛋白質(zhì)容易凝固變性，蛋白質(zhì)隨著含水量的增加，所需凝固溫度降低；濕熱滅菌中蒸汽的穿透力比干燥空氣大；蒸汽在被滅菌物體表面凝結(jié)，釋放出大量的汽化潛熱，能迅速提高滅菌物體表面的溫度，從而增加滅菌效力。實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌鍋有非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋和自控式滅菌鍋，其結(jié)構(gòu)和工作原理是相同的。本實(shí)驗(yàn)介紹的是非自控手提式高壓蒸汽滅菌鍋，自控式滅菌鍋的使用可參考廠家說(shuō)明書(shū)。具體操作步驟如下：加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒(méi)過(guò)加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過(guò)少，滅菌鍋會(huì)發(fā)生燒干引起炸裂事故。裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以對(duì)稱方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，并打開(kāi)排氣閥。排氣：打開(kāi)電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。升壓：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開(kāi)始上升。保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時(shí)，控制電源，開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需的時(shí)間。如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5℃，20分鐘滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。降壓：達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”后，方可打開(kāi)排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓，打開(kāi)鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開(kāi)排氣閥，開(kāi)蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。無(wú)菌檢查：將已滅菌的培養(yǎng)基放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，檢查無(wú)雜菌生長(zhǎng)后，即可使用。（三）過(guò)濾除菌有些物質(zhì)，如抗生素、血清、維生素、糖溶液等采用加熱滅菌法時(shí)，容易受熱分解而被破壞，因而要采用過(guò)濾除菌法。過(guò)濾除菌是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體或氣體中細(xì)菌的方法，該方法最大的優(yōu)點(diǎn)是不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。過(guò)濾除菌法除實(shí)驗(yàn)室用于溶液、試劑的除菌外，在微生物工作中使用的凈化工作臺(tái)也是根據(jù)過(guò)濾除菌的原理設(shè)計(jì)的，可根據(jù)不同的需要來(lái)選用不同的濾器和濾板材料。應(yīng)用最廣泛的過(guò)濾器種類有：微孔濾膜過(guò)濾器：是一種新型過(guò)濾器，它由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料盒組成，出口處可連接針頭，入口處可連接針筒，使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料盒之間，旋緊盒蓋，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，各種微生物被阻留在微孔濾膜上面，而液體和小分子物質(zhì)通過(guò)濾膜，從而達(dá)到除菌的目的。其濾膜是由硝酸纖維素、醋酸纖維素等制成的薄膜，有孔徑大小不同的多種規(guī)格（如0.1μm、0.22μm、0.3μm、0.45μm等），實(shí)驗(yàn)室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。該濾器的優(yōu)點(diǎn)是吸附性小，即溶液中的物質(zhì)損耗少，過(guò)濾速度快，每張濾膜只使用1次，不用清洗。蔡氏（Seitz）過(guò)濾器：是一種金屬制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部分是一種用石棉纖維和其他填充物壓制成的片狀結(jié)構(gòu)。溶液中的細(xì)菌通過(guò)石棉纖維的吸附和過(guò)濾而被去除，但對(duì)溶液中其他物質(zhì)的吸附性也大，每張纖維板只能使用1次。玻璃過(guò)濾器：是一種玻璃制成的過(guò)濾漏斗，其過(guò)濾部分是由細(xì)玻璃粉燒結(jié)成的板狀構(gòu)造。玻璃濾器的規(guī)格很多，5號(hào)（孔徑2~5μm）和6號(hào)（孔徑<2μm）適用于過(guò)濾細(xì)菌，其優(yōu)點(diǎn)是吸附量少，但每次使用后要洗凈再用。本實(shí)驗(yàn)采用微孔濾膜過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，具體操作步驟如下：組裝、滅菌：將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊壓平，包裝滅菌后待用（0.1Mpa，121.5℃，滅菌20分鐘）。連接：將滅菌濾器的入口在無(wú)菌條件下，以無(wú)菌操作方式連接于裝有待濾溶液的注射器上，將針頭與出口