項(xiàng)目八微生物數(shù)量檢查技術(shù)任務(wù)4計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證技能點(diǎn)3更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證3更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證3.1實(shí)訓(xùn)目的了解供試品特性及其微生物總數(shù)限度標(biāo)準(zhǔn)。熟悉微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證用菌液的制備方法。掌握方法驗(yàn)證的操作步驟并能對驗(yàn)證結(jié)果做出準(zhǔn)確判斷。3.2實(shí)訓(xùn)要求嚴(yán)格遵守實(shí)訓(xùn)室管理規(guī)章制度。按照實(shí)訓(xùn)計(jì)劃進(jìn)行操作。認(rèn)真分析和討論實(shí)訓(xùn)中出現(xiàn)的問題。尊重實(shí)訓(xùn)結(jié)果的科學(xué)性。完成實(shí)訓(xùn)任務(wù),達(dá)到實(shí)訓(xùn)目的。

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證3.3實(shí)訓(xùn)內(nèi)容3.3.1實(shí)驗(yàn)環(huán)境無菌室、超凈工作臺。3.3.2設(shè)備、儀器儀器、試劑、菌種及培養(yǎng)基設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱30～35℃、生化培養(yǎng)箱23～28℃、勻漿杯。儀器菌落計(jì)數(shù)器、錐形瓶(250～300ml,500ml,1000ml)、培養(yǎng)皿(直徑

9cm)、帶塞試管(18mmx180mm,28mm×198mm)、吸管(1ml分度0.01,10ml分度0.1)。玻璃器皿均于高壓蒸汽121℃滅菌30min,烘干。用具白金耳、酒精燈、滅菌剪刀和鑷子、試管架、火柴、記號筆、白瓷盆、實(shí)驗(yàn)記錄紙

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證3.3.3試劑0.9%無菌氯化鈉溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、靛基質(zhì)試液3.3.4驗(yàn)證用菌種及培養(yǎng)基大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念球菌、黑曲霉菌;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌液、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證3.4實(shí)驗(yàn)步驟3.4.1菌液制備取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物2～3白金耳加入9ml0.9%氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-3～10-7約為50～100cfu/ml,做活菌計(jì)數(shù)用。取經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物2～3白金耳加入9m10.9%

氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-3～10-7約為50～100cfu/ml,做活菌計(jì)數(shù)備用。取經(jīng)培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物,加0.9%氯化鈉溶液3ml,洗下霉菌孢

子,取0.1ml加入9ml0.9%氯化鈉溶液中,10倍稀釋至10-3～10-7約為50～100cfu/ml,做活菌計(jì)數(shù)備用。更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證3.4.2操作方法供試液制備取本品10g置勻漿杯中，加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、靛基質(zhì)試液100ml,以4000r/min開機(jī)2min,即為1:10的供試液。驗(yàn)證方法采用常規(guī)法。驗(yàn)證試驗(yàn)分4組,至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn),并分別計(jì)算供試品組和對照組試驗(yàn)的菌回收率。菌液組:分別取上述5種菌液1ml,注入平皿中,傾注培養(yǎng)基,待凝后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)。供試品對照組:取1：10供試液1m注入平皿中,傾注培養(yǎng)基,待凝后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)。

更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)組:取供試液1ml按供試品對照組同法操作,同時(shí)每個(gè)平皿加入50～100cfu相應(yīng)試驗(yàn)菌1ml,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)。稀釋劑對照組:取相應(yīng)的稀釋劑1ml注入每個(gè)平皿中,并加入50~100cfu相應(yīng)

試驗(yàn)菌1ml,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h,觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)。3.5注意事項(xiàng)檢驗(yàn)全過程要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作。吸取供試液時(shí)要先搖勻。供試液從制備到加入培養(yǎng)基不能超過1小時(shí)。更年寧微生物總數(shù)檢查方法驗(yàn)證項(xiàng)目八微生物數(shù)量檢查技術(shù)任務(wù)4計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證知識點(diǎn)4計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.1驗(yàn)證目的為了使微生物學(xué)檢驗(yàn)方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，需要對每個(gè)品種的具體檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.2驗(yàn)證的影響因素：藥品本身的抑菌性藥品中防腐劑的抑菌性培養(yǎng)基的促菌生長能力培養(yǎng)條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）過濾系統(tǒng)的材質(zhì)計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.3驗(yàn)證用菌試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌(

Eerhenichin

co)；金黃色葡萄球菌(

Staphylococcus

aureus)；乙型副傷寒沙門菌(

Salmonella

paratyphi

B)；枯草芽泡桿菌(

Bocillus

subtilis)；白色念珠菌(

Candida

albicans)；黑曲霉(

Spergillus

niger)。

計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.4菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18～24h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48h。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1m含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5-7天，加入3～5ml含0.05%(m/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2h內(nèi)使用；若保存在2～8℃，可在24h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2~8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.5驗(yàn)證方法驗(yàn)證試驗(yàn)分4組，至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組對照組和試驗(yàn)組的菌回收率。4.5.1試驗(yàn)組

取最低稀釋級的供試液，按每1ml供試液加入50～100cfu試驗(yàn)菌，按菌落計(jì)數(shù)方法定其菌數(shù)。平皿法計(jì)數(shù)時(shí)，取試驗(yàn)菌液、供試液各1m分別注入平皿中，立即傾注球脂培養(yǎng)基：薄膜過濾法計(jì)數(shù)時(shí)，取供試液2ml過濾，沖洗液沖洗，并在最后一次的沖洗液中加入試驗(yàn)菌。4.5.2菌液組取上述試驗(yàn)菌液，測定其加入的試驗(yàn)菌菌數(shù)。4.5.3供試品對照組取最低稀釋級的供試液1ml，按菌落計(jì)數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。

計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.5.4稀釋劑對照組為考察供試液制備過程中對微生物影響的程度，可用相應(yīng)的稀液替代供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終菌濃度為每1ml含50～100cfu，按供試品組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測定其菌數(shù)。4.6回收率計(jì)算計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.7結(jié)果判定在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)應(yīng)均不低于70%。若試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率)均不低于70%，照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌數(shù)回收率低于70%，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證步驟4.7結(jié)果判定若沒有適宜的方法消除供試品的抑菌活性，那么驗(yàn)證試驗(yàn)中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時(shí)表明該供試品不能被試驗(yàn)菌污染。但是，供試品也可能僅對試驗(yàn)用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)