銅綠假單胞菌金屬-內(nèi)酰胺酶與亞胺培南耐藥的相關(guān)性研究

近年來，銅綠假單胞菌對碳綠霉素類抗生素的耐藥性逐年增加，給治療帶來了重大挑戰(zhàn)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1銅綠假單胞菌分離情況實驗菌株由廣州市花都區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2009年10月-2012年6月住院及門診患者標本中分離的銅綠假單胞菌共216株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853與大腸埃希菌ATCC25922，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。1.1.2pcrma和細儀器為法國生物梅里埃公司的VITEK32全自動微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)，M-H瓊脂為廣州環(huán)凱生物有限公司，亞胺培南（IPM,10μg/片）、頭孢他啶（CAZ,30μg/片）均購自英國OXl0D公司，EDTA(100raM,10ul/片），PCRMIX來自廣州東盛生物科技有限公司。引物由上海英駿生物有限公司合成。1.1.3引用的順序如表1所示1.2方法1.2.1-內(nèi)酰胺-金屬絲采用雙紙片協(xié)同法檢測金屬β-內(nèi)酰胺酶，按照紙片擴散法標準操作1.2.2一般離子檢測采用煮沸法提取細菌DNA1.2.3pcr擴增體系細菌質(zhì)粒DNA的提取采用SDS堿裂解法，按照產(chǎn)品說明配制PCR體系，PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃4min;94℃30s,55℃30s,72℃1min，循環(huán)30次；72℃8min。1.2.4質(zhì)量控制每周按標準嚴格使用質(zhì)控菌銅綠假單胞菌ATCC27853與大腸埃希菌ATCC25922對實驗進行質(zhì)量控制。2結(jié)果2.1標本來源及分布攜帶金屬β-內(nèi)酰胺酶的菌株共檢測出80株，占37.03%（80/216），來源科室主要是ICU、內(nèi)科及外科，分別是33例（41.25%），18例（22.5%），14例（17.5%），標本大部分來自患者痰，占61.25%（49/80），患者男54例，女26例，平均年齡77歲。2.2mbl菌株的確定216株臨床分離株通過雙紙片協(xié)同法檢出80株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBL），其中78.75%（63/80）的MBL菌株都是多藥耐藥菌株，甚至有18.75%（15/80）是泛耐藥株。藥敏試驗結(jié)果中，耐藥性最高的前三位是氨曲南，環(huán)丙沙星和哌拉西林，耐藥率都達77%以上，見表2。2.3攜帶imp基因檢測對80株MBL菌株進行IMP與VIM基因擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)23株（28.75）攜帶IMP基因，9株（11.25%）被檢測到有攜帶VIM基因，它們的長度分別是587bp與645bp。見圖1、圖2。其中9株攜帶VIM基因的菌株都對亞胺培南抗生素耐藥，而87.5%的VIM與IMP基因陽性菌株都是多藥耐藥。2.4亞胺培南耐藥菌株類整合子陽性率Ⅰ類整合子檢出率卻達MBL陽性菌株的82.5%（66/80），電泳圖可見457bp大小目的片段，見圖3。其中亞胺培南耐藥菌株中Ⅰ類整合子陽性率占85.71%（48/56）。未檢出SPM與GIM基因。3金屬酶的檢測近幾年，產(chǎn)金屬酶的銅綠假單胞菌備受臨床關(guān)注，正由于金屬酶能水解幾乎所有的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，甚至出現(xiàn)了超級細菌攜帶NDM-1基因金屬酶，給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)。本研究結(jié)果表明，產(chǎn)生金屬酶的銅綠假單胞菌對各類抗生素耐藥率高，達70%以上，根據(jù)中國CHINET的數(shù)據(jù)，銅綠假單胞菌對各種抗生素的耐藥率一般都是30%左右檢測金屬酶的方法有許多，入PCR法、E-test法、三位試驗、紙片增效法及紙片協(xié)同法，本文利用金屬酶的特征：二價金屬離子與EDTA等有機絡合劑絡合的關(guān)系，從而觀察抑菌圈增大來判斷細菌是否產(chǎn)生金屬酶金屬酶又分為先天型和獲得型，銅綠假單胞菌大部分都是獲得型金屬酶，有五種類基因型VIM、IMP、SPM和GIM、SIM，其中最常見的是IMP和VIM。大多數(shù)獲得性金屬酶位于可移動的整合子中，少數(shù)通過可移動的共同區(qū)域（cR）進行轉(zhuǎn)移由于本院感染的銅綠假單胞菌產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的檢出率較高，且其耐藥率較非產(chǎn)酶的銅綠假單胞菌明顯增高，因此，在臨床用藥治療時必須依據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇敏感的抗生素成為治療關(guān)鍵