傳統(tǒng)的藥敏實驗

SJKim,TheUnion結核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法課件藥敏試驗的目的耐藥監(jiān)測 -評估治療方案 -選擇有效的標準方案病例管理 -診斷耐藥結核病(耐多藥/廣泛耐藥結核?。?為個體病例(耐多藥/廣泛耐藥結核病）選擇有效的方案

藥敏試驗的目的耐藥監(jiān)測

問題

?

可靠性:技術重復性/臨床反應預

測?

周轉時間?操作可行性及可持續(xù)性?成本問題

基于標本的藥敏檢測系統(tǒng)直接法直接涂片法（涂片陽性）

優(yōu)點:結果快;更好的反映耐藥情況

缺點:大多數(shù)藥敏試驗不理想;接種量不容易標化/

可行性較差

-間接法

對結核分枝桿菌進行培養(yǎng)后進行藥敏試驗

優(yōu)點:更好的控制接種量

缺點:結果延遲基于標本的藥敏檢測系統(tǒng)以傳統(tǒng)的生長檢測為基礎的藥敏試驗方法

以傳統(tǒng)生長檢測為基礎的方法WHO（1963）的標準方法

絕對濃度法-Meissner

-標化接種量;藥物濃度梯度抗性比率法-Mitchison-克服培養(yǎng)基中藥物濃度變化的缺點

比例法-Canetti/Grosset

-

臨界濃度比例,更好的控制接種量

[GCanetti/JGrosset,France;SFroman,USA;PHauduroy,Switzerland;MLangerova/LSula,Czechoslovakia;HTMahler(WHO);GMeissner,Germany;DAMitchison,England]以傳統(tǒng)的生長檢測為基礎的藥敏試驗方法以快速培養(yǎng)生長檢測為基礎的藥敏試驗方法

快培生長系統(tǒng)觀察顯微鏡下的微小菌落:-玻片培養(yǎng)；顯微鏡觀察的藥敏試驗（MODS）代謝情況檢測:

-CO2

產(chǎn)生量(放射BACTEC460;

色素變化

MB/Bact3D)-O2

消耗

(熒光產(chǎn)生

MGIT960)-TREK系統(tǒng)

(ESP培養(yǎng)系列

II)-微盤：

阿莫拉藍試驗(指示管)/TEMA-ATP產(chǎn)生,生物熒光試驗

噬菌體檢測:FASTPlaque;Bonxbox(LRP)以快速培養(yǎng)生長檢測為基礎的藥敏試驗方法

以檢測基因突變?yōu)榛A的快速藥敏試驗系統(tǒng)擴增目標區(qū)的DNA測序

聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析技術;-探針雜交：反向探針線性雜交方法；Hain

分枝桿菌藥物抗性plus分子燈塔/信標：GeneXpert系統(tǒng)是一個將樣品準備、定量擴增和熒光檢集于一身并自動進行核酸檢測分析的系統(tǒng);LAMP(Eiken)核酸環(huán)介導等溫擴增技術高效液相色譜應用與擴增的DNA的突變檢測以檢測基因突變?yōu)榛A的快速藥敏試驗系統(tǒng)藥敏試驗的結果可靠性治療結果的預測值-藥敏試驗的耐藥標準試驗可靠性-試驗精確度&可重復性藥敏試驗的結果可靠性藥敏試驗的校正

獲得最相關的臨床耐藥標準▽

可能的敏感株的敏感級別▽在治療反應變化方面測定敏感性水平?從未接受過治療的患者(PS)與至少接受5/6個月治療的患者(PR)的標本菌株的敏感性進行比較

PS=>100菌株;PR=>50菌株CanttiG,etal.BullWHO1969;41:21-43.藥敏試驗的校正

獲得最相關的臨床耐藥標準CanttiG,

可能敏感菌株/（可能無耐藥性菌株）在不同藥物濃度下的抑菌分布Minimalinhibitoryconcentrations(MIC)最小抑菌濃度FrequencyofstrainsClinicallysusceptiblestrains(PS)Breakpoint1SD3SD

可能敏感菌株/（可能無耐藥性菌株）在不同藥物濃度下的抑菌分

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布

FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*Technicalvariation(inoculum/media/drugconcent.)Clinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)PSPR2mcg/mlBreakpoint13.1as“R”75.811.1as“S”

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布

可能敏感/可能耐藥菌株對利福平的最小抑菌濃度的累積分布（此試驗采用L-J培養(yǎng)基用絕對濃度法）85.8

可能敏感/可能耐藥菌株對利福平的最小抑菌濃度的累積分布（此

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布

FrequencyofstrainsMinimalinhibitoryconcentrations(MIC)Breakpoint*InoculumvariationClinicallysusceptiblestrains(PS)Clinicallyresistantstrains(PR)

不同藥物濃度下可能敏感菌株和可能耐藥菌株最低抑菌濃度的分布

可能敏感和可能耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株對氧氟沙星敏感性分析采用L-J培養(yǎng)基Donotquotethisdata!(n=81)(n=111)

可能敏感和可能耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株對氧氟沙星敏感性

校正的乙胺丁醇的臨界濃度

(此試驗采用改良羅氏培養(yǎng)基的絕對濃度法)42%50%

校正的乙胺丁醇的臨界濃度

(此試驗采用改良羅氏培養(yǎng)基的絕

可能敏感和可能耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株對卡那霉素敏感性分析InL-JMediumIn7H10Medium67%67%

可能敏感和可能耐藥的結核分枝桿菌臨床分離株對卡那霉素敏感性抗結核藥物的最低抑菌濃度比平均峰值EMBETHOFXCFXINHRMPKMCPMPASSM抗結核藥物的最低抑菌濃度比平均峰值EMBETHOFXCFXI推薦的臨界濃度藥物LJ*7H107H11Bactec460MGIT960異煙肼0.20.20.20.10.1利福平40.01.01.02.01.0乙胺丁醇2.05.07.52.55.0鏈霉素4.02.02.02.01.0吡嗪酰胺NRNRNR100.0100.0卡那霉素30.05.06.04.0阿米卡星40.01.01.0卷曲霉素40.010.010.01.252.5環(huán)丙沙星2.02.02.02.01.0氧氟沙星2.02.02.02.02.0莫西沙星0.50.25加替沙星1.0乙硫異酰胺5.010.02.55.0丙硫異煙胺40.01.252.5PAS1.02.08.02.0環(huán)絲酰胺40.0NRNRNRNR氨苯硫脲NRNRNRNRNR利奈唑酮1.01.0*ProportionWHO推薦藥敏試驗的臨界濃度,2007推薦的臨界濃度藥物LJ*7H107H11Bactec460抗結核藥物藥敏試驗程序復雜：必須在有質(zhì)量保證的實驗室才能實施2.試驗操作危險大：操作只能在擁有好的設施及設備的實驗室(BSL-3)進行，而且所有的實驗室工作人員都要熟練的掌握每個程序抗結核藥物藥敏試驗影響藥敏試驗結果的物理化學環(huán)境因素培養(yǎng)基中活動性/精確的藥物濃度藥粉.試劑效價：劑量/溶解/稀釋/存儲

purityxactivefractionxH2O

EMB:99%purity;C10H24N2O2.2HCl(277.2-72.9=204.3);nowater;0.99x0.74x1.0=0.7326;1000mg→733mg-培養(yǎng)物的制備：(1)滅菌過程中熱失活(2)蛋白結合；(3)拮抗劑/離子(4)pH值接種量:-接種量/離散度/可代表性-組織物的可行性試驗影響藥敏試驗結果的物理化學環(huán)境因素濃縮過程中利福平的穩(wěn)定性濃縮過程中利福平的穩(wěn)定性抗結核藥物的儲存在密封的硅膠容器內(nèi)儲存(最好在真空下儲存)結核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗方法課件藥敏試驗接種物的制備Inoculate0.1mlvolumeofinoculumontoeachmedium藥敏試驗接種物的制備Inoculate0.1ml比例法

(byMiddlebrook&Cohn)Dilute稀釋1mg/mlbacterial

suspensionto10-3&10-5mg/mlbyserial10folddilution.Plant

接種0.1mlontoeachslopeofdrug-freeorcontainingmedium制備培養(yǎng)基Observe觀察thegrowthafter4weeksincubation(ifthegrowthispoor,againafter6weeks).觀察4周生長情況（如果培養(yǎng)基質(zhì)量較差應觀察6周）Report

報告theproportionofcoloniesgrownatthecriticalconcentrationofthedrug.在藥物的臨界濃度報告結果

DrugfreeIsoniazidEthambutolInoculummedia0.2mcg/ml2.0mcg/ml

10-3+++++310-52690%resistant34.60.1InterpretationResistantSusceptible比例法

(byMiddlebrook&Cohn)Di藥敏試驗結果-11.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/?orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/?ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/?bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/?.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(?/?)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)13+2+11870TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)2282000InterpretationR(7.1)(2/28x100)S(0.03)(1/2800x100)S(0.6)(18/2800x100)S(0.3)(7/2800x100)MTB藥敏試驗結果-11.Ifusenichromewi藥敏試驗結果-21.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/?orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/?ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/?bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/?.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(?/?)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)14+2+21+3+0TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)22+50010Interpretation?S??MTB藥敏試驗結果-21.Ifusenichromewi藥敏試驗結果-31.Ifusenichromewire(0.7mmwire/3mmofinternaldiameter),inoculateone

loopfulofbacterialsuspensionof10-2㎎/?orifusepipette,inoculate0.1mlof10-3㎎/?ofbacterialsuspension2.Ifusenichromewire,inoculateoneloopfulof10-4㎎/?bacterialsuspension

orifusepipette,inoculate0.1mlof10-5㎎/?.DrugNoneINHRIFSMEMBPNBConcentrations(?/?)00.240.04.02.0500.0TubeNoC1H1R1S1E1PBInoculum(10-4

㎎)13515000TubeNoC2H2R2S2E2Inoculum(10-6

㎎)200000InterpretationRR??MTB藥敏試驗結果-31.Ifusenichromewi藥敏試驗的技術可靠性外部質(zhì)量評估藥敏試驗的技術可靠性外部質(zhì)量評估

17個跨國參比實驗室網(wǎng)絡第14輪熟練度測試結果

（數(shù)據(jù)來源于ArmandVanDeun

2007年）敏感性特異性效能可重復性Isoniazid異煙肼S敏感=13R耐藥=17Average(%)99999998100%13141114<95%4313Rifampicin利福平S敏感=10R耐藥=17Average(%)99999998100%14141214<95%3323StreptomycinS敏感=11R耐藥=16Average(%)97919594100%121179<95%5688EthambutolS敏感=17R耐藥=4Average(%)88979697100%1113811<95%6476藍色數(shù)字表示實驗室數(shù)量

17個跨國參比實驗室網(wǎng)絡第14輪熟練度測試結果

（數(shù)據(jù)來

51個國家（或地區(qū)）參比實驗室利福平和異煙肼藥敏試驗結果的一致性

（世界衛(wèi)生組織第四期全球耐藥報告，2008）%Agreement一致性Isoniazid異煙肼Rifampicin利福平10038(77.6)37(72.5)95-996(12.2)9(17.6)90-944(8.2)5(9.8)<901(2.0)0Totalnumberoflabs合計49(100.0)51(100.0)

51個國家（或地區(qū)）參比實驗室利福平和異煙肼藥敏試驗結果TestDrug藥物敏感性(%)特異性(%)患病情況下的耐藥結果預測值(%)1%15%1