常用中藥的生物鑒定第1頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月常用中藥的生物鑒定方法免疫鑒定法電泳鑒定法生物效價鑒定法單純指標(biāo)鑒定法細(xì)胞生物學(xué)鑒定法DNA遺傳標(biāo)記鑒定法mRNA差異顯示鑒定法第2頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(PolymeraseChainReaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。第3頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月少量DNA樣品快速擴(kuò)增amplify技術(shù)。

(inventedbyKaryMullis,wonaNobelPrizeinChemistryin1993)第4頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月原理第5頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月

PCR要件模板Template

引物

Primers:

SmallpiecesofDNA. Madeupof15to30bases.

BindstheDNAataspecificregion. forwardandreverse正向和逆向酶Enzyme:

TaqDNApolymerase

PCR核酸Nucleotides:

Substrate,fourdeoxyribonucleotides(A,C,G,T) dNTP第6頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月MDistH2O 117ul10Xbuffer 15uldNTP 12ulPrimer1 3ulPrimer2 3ulTaqpolymerase 0.75ul200ultubePipette上下混合第7頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月取出15ul剩下的加入3ulTemplateDNA用pipette上下混合分裝入tube15ul/支標(biāo)上1…….51234554°C56586062RunPCRTcTc55°C不加模板的對照組M

第8頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月加入1ul模板DNA不加引物但有模板的對照Pc第9頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月15ulMTC3ultemplate(T)PipettemixTC15ul/tubepcPC123451ultemplateT第10頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月TCPC1234554555657586062oCRNU第11頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月ProgramDenature95°C 5minDenaturation變性：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，一般加熱至90－95℃,30secAnnealing褪火：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈，55－70℃，固稱其為褪火。mostimportantfactorinthePCR,45secExtension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈,溫度為70－75oC,1.5minFinalextension72°C,5min第12頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第13頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第14頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第16頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第17頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第18頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第19頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第20頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第21頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第23頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第24頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月2x106第25頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月優(yōu)點:needverysmallamountofsample缺點: amplifiedproductmaybecontaminated withothersamplesnotrelatedtothe one第26頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月FactorsaffecttoPCRMg+2concentration,

Mg+2

specificity

0.1~5mmol/LMg+2預(yù)實驗Primer(引物)specificityDegenerateprimer---tofindthetargetgeneinthecloselyrelatedspeciesspecificity,nonspecificproducts第27頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月AnnealingTemperature Toohigh noPCRproduct Toolow muchnonspecificproduct gradientTempPCRmachine findthesuitableTempTaqpolymerasequalityTemplate(模板)DNAquality第28頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR產(chǎn)物鑒定Agarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%AgaroseinTAEbuffer(17ml)boilPourintothetray(assembledgelapparatus)第29頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月AfterPCRamplificationAgarosegelelectrophoresistocheckproduct1.5%agarosein17mlTAE(4mmthick)5ulproductadd1ul6Xloadingdyemix1Kbmarker2.5ul100Vrun25-30minEBstain10min(EB致癌物,戴手套),photograph第31頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月1.51.00.50.2Kb10gammaprimerMismatch3base10gammaprimercompletematch第32頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR的應(yīng)用1.detectiongeneticallymodificationorganism (GMO)檢測轉(zhuǎn)基因生物，找出特異的基因或片段 find

specificgeneorfragment(promoter)

2.unculturedmicroorganism3.pathogenidentification4.detectioninsertionsequence(cloning)第33頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月提取模板反應(yīng)體系配置PCR擴(kuò)增電泳引物設(shè)計第34頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月烏梢蛇為《中國藥典》(2010版)一部收載的一種常用中藥，來源于游蛇科動物烏梢蛇[Zaocysdhumnades(Cantor)]的干燥體。有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙之功效。用于風(fēng)濕頑痹、麻木拘攣、半身不遂、抽搐痙攣、瘰癘惡瘡。商品流通中多以紅點錦蛇、黑眉錦蛇、玉斑錦蛇、王錦蛇、灰鼠蛇等來混作正品藥材進(jìn)行銷售，這些品種多數(shù)與烏梢蛇同科不同屬，因其來源相近，造成鑒定困難。此外，藥材在加工處理時剖去內(nèi)臟后，要進(jìn)行干燥熏黑處理，皮上的花紋特征、顏色幾近消失，難以辨認(rèn)，而且其大小、形態(tài)特征與烏梢蛇相近，這是造成其性狀鑒別困難的另一重要原因。鑒于烏梢蛇作為中藥的臨床功效確切，但商品來源復(fù)雜、藥材性狀鑒別困難的現(xiàn)狀，為滿足目前市場常見混偽品的鑒別要求，尋找經(jīng)濟(jì)實用、準(zhǔn)確便捷、穩(wěn)定性高的方法，應(yīng)用高特異性PCR方法對烏梢蛇藥材及其混淆品的原動物和炮制品進(jìn)行鑒別。第35頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月高特異性PCR方法鑒別烏梢蛇及其混淆品第36頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月功效：祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙。市售混淆品：紅點錦蛇、黑眉錦蛇、玉斑錦蛇、王錦蛇、灰鼠蛇等第37頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月烏梢蛇高特異性

PCR鑒別引物的設(shè)計從GenBank下載正品原動物烏梢蛇及混偽品線粒體12SrRNA基因序列經(jīng)DNAMAN軟件對位排列分析正、混品間DNA序列差異，設(shè)計出一對能特異性擴(kuò)增烏梢蛇12SrRNA基因片段的特異性鑒別引物HWL-1和HWH-1

（上海生工生物合成公司）第38頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月模板DNA的提取

基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

第39頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月特異性PCR鑒別反應(yīng)體系：

Tris-HCl10mmol/L

氯化鉀50mmol/LMg2+1.5mmol/LdNTP0.15μmol/LTaq1U(40ml)

引物0.15μmol/L

模板DNA50ng第40頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月步驟預(yù)變性95°C 4min

變性95°C40sec褪火65°C1min延伸72°C30sec延伸72°C5min設(shè)置無DNA模板的陰性對照通用引物構(gòu)成的陽性對照25cys第41頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月瓊脂糖凝膠電泳取5μl反應(yīng)液經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳EB染色紫外凝膠分析檢測成像第42頁，課件共46頁，創(chuàng)作于2023年2月結(jié)