ICS

11.220CCS

B

41DB42 DB42/T

—2022家禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程第

2

測Code

diseases

seriesPart

Testmethodof

dual

probe

for

detecting

coli 湖北省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB42/T

1864.2—2022 前言

.................................................................................

II引言

.................................................................................

IV1

范圍

................................................................................

12

規(guī)范性引用文件

......................................................................

13

術(shù)語和定義

..........................................................................

14

縮略語

..............................................................................

15

原理

................................................................................

16

試驗條件

............................................................................

27

儀器設(shè)備

............................................................................

28

試劑或材料

..........................................................................

29

試驗步驟

............................................................................

310

結(jié)果判定

...........................................................................

411

生物安全措施

.......................................................................

4DB42/T

1864.2—2022 本文件按照GB/T

—《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件DB42/T

1864《家禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程》為系列標準。本部分為DB42/T

18642部分。DB42/T

1864發(fā)布了以下部分：——第

1

部分：家禽主要腫瘤病病原鑒別?！?/p>

2

部分：禽大腸桿菌致病群雙重探針法檢測——第

3

部分：雞沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜酸菌和空腸彎曲菌三重熒光

PCR

檢測方法?！?/p>

4

部分：禽白血病抗原

檢測方法。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所提出。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口管理。本文件起草單位：湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所、湖北省動物疫病預防控制中心。本文件主要起草人：張文婷、羅青平、邵華斌、周艷君、金鑫、張騰飛、溫國元、王紅琳、商雨、汪宏才、張蓉蓉、盧琴、羅玲。本文件實施應(yīng)用的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話：，郵箱：hbsnab@126.co郵箱：IIDB42/T

1864.2—2022 2012～2020禽疫病診斷技術(shù)規(guī)程》系列標準，擬由4個部分構(gòu)成?！?/p>

J

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的快速檢測，指導家禽腫瘤病的快速鑒別診斷?！诙糠郑呵荽竽c桿菌致病群雙重探針法檢測。目的在于檢測家禽泄殖腔拭子和糞便中的致病群大腸桿菌，指導家禽致病群大腸桿菌的快速檢測?！谌糠郑弘u沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌三重熒光

PCR

檢測方法。目的在于檢測雞肉及相關(guān)產(chǎn)品、雞泄殖腔拭子和糞便中的沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和空腸彎曲菌，指導雞肉及相關(guān)產(chǎn)品細菌性疾病的快速檢測?！谒牟糠郑呵莅籽】乖?/p>

ELISA

檢測方法。目的在于檢測種雞群蛋清、血漿、精液、胎糞、肛拭子中禽白血病抗原

檢測，指導種雞場禽白血病的凈化檢測。IVDB42/T

1864.2—2022

1 范圍定。本文件適用于檢測家禽泄殖腔拭子和糞便中的致病群大腸桿菌。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB

19489 實驗室生物安全通用要求GB/T

27403 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學檢測NY/T

動物產(chǎn)品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢測方法3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1大腸桿菌致病群

coli

phylogenetic

group根據(jù)系統(tǒng)進化分類，將大腸桿菌分為B2、D、B1和A群，其中B2D群大腸桿菌稱為致病群大腸桿菌。3.2熒光 realtime

PCR一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學物質(zhì)測每次聚合酶鏈式反應(yīng)（）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。4 縮略語下列縮略語適用于本文件。BHQ1：黑洞淬滅劑-l（

Hole

Quencher-1）Ct值：循環(huán)閾值（Cycle

threshold）FAM：熒光素酰胺（

Amidite）HEX：六氯熒光素（

Fluorescein）5 原理chuAyiaATspE4.

C2B2B1

DB42/T

1864.2—2022本文件采用TaqmanchuA基因、yiaA基因和TspE4.

C2菌可被分為B2、D、B1和A1B2群和D大腸桿菌毒力島基因chuA和yiaA，設(shè)計特異的引物和熒光探針，建立了一種禽大腸桿菌致病群篩選的Taqman雙重探針檢測方法，根據(jù)對應(yīng)的熒光曲線反應(yīng)和Ct值來判斷禽大腸桿菌的致病群。表1 大腸桿菌種群的判定6 試驗條件7儀器設(shè)備7.1

熒光定量

PCR

7.2

二級生物安全柜。7.3

渦旋震蕩器。7.4

微量移液器（規(guī)格為

1

mL、100

μL、50

μL

和

2.5

μL）。7.5

恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。7.6

臺式冷凍小型離心機（轉(zhuǎn)速≥12

000

）。8 試劑或材料8.1 試劑配制本方法試驗用水應(yīng)按照

6682GB/T27403規(guī)定實施。8.2 試劑或材料8.2.1 Cary-Blair

運送培養(yǎng)基。8.2.2 熒光定量

探針預混物。8.2.3 商品化的細菌基因組

DNA

提取試劑盒。8.2.4 chuA

基

因

引

物

與

探

針

：

上

游

引

物

，

下

游

引

物

：5’-TGCCGCCAGTACCAAAG-3’，探針：5’3’。8.2.5 yjaA

基

因

引

物

與

探

針

：

上

游

引

物

5’-GAAAGCAAACGTGAAGTGTCAG-3’

，

下

游

引

物

：DB42/T

1864.2—20225’-GGTGGAGTTGCAGAACAAGA-3’，探針：5’-HEX-CCAGCGCCTGTTAATCGCCAATTT-BHQ1-3’。8.2.6 陽性對照

1：chuA

基因的陽性克隆分子

或陽性標準菌株

。8.2.7 陽性對照

2：yjaA

基因的陽性克隆分子

或陽性標準菌株

。8.2.8陰性對照：無菌蒸餾水或去離子水。8.2.9 無

DNase/RNase

的

qPCR

EP

管（

）、微量移液器對應(yīng)的槍頭。9 試驗步驟9.1 樣品的采集與前處理9.1.1 泄殖腔拭子樣品用無菌的棉拭子插入雞泄殖腔內(nèi)2

cm至3

處并輕輕旋轉(zhuǎn)，將有可見糞便的棉拭子放入含有1

mL～2

mL運送培養(yǎng)基中，冷藏箱保存，樣品保存時間不超過24

h。9.1.2 糞便樣品先采集雞新鮮糞便1

g～2

g于一次性無菌采便管內(nèi)，然后轉(zhuǎn)移至含有1

mL～2

運送培養(yǎng)基中，冷藏箱保存，樣品保存時間不超過24

h。9.2 大腸桿菌的分離鑒定大腸桿菌的分離鑒定按照NY/T

9.3 樣品

的制備9.3.1

℃±1℃培養(yǎng)

h～24

h。12

r/min

2

min，去盡上清，沉淀用于核酸提取。9.3.2 在沉淀中，加入

100

μL

提取液充分混勻，沸水浴

10

min，在

4

離心

5min，上清可直接用于熒光

反應(yīng)。9.3.3 也可以使用商品化的

DNA

提取試劑盒提取

DNA

模板，具體步驟參照說明書。9.4 熒光

9.4.1 反應(yīng)體系以制備的為模板進行雙重熒光定量PCR25

10

mmol/L）各0.6

μL，探針（

0.8

μL，熒光定量PCR探針預混物12.5

μL，模板DNA1

μL。用滅菌的去離子水補足體積至25

μL。9.4.2 反應(yīng)條件熒光反應(yīng)在多通道熒光定量儀上進行，選擇熒光信號和（分別檢測chuA-FAM，yjaA-HEX反應(yīng)參數(shù)：95℃預變性5

；然后95℃

變性10

，58.1℃退火并延伸30

，擴增40個循環(huán)；延伸結(jié)束時開始進行雙重熒光信號檢測。閾值設(shè)置為閾值線超過正常陰性樣品擴增曲線的最高點。9.4.3對照通道Ct

FAM≤35

chuA

Ct

40

chuA

35Ct

35

CtchuAchuA

HEX≤35

yjaA

Ct

40

yjaA

35Ct

35

CtyjaAyjaA

B2

chuA

yjaA

chuA

yjaA

chuA

yjaA

DB42/T

1864.2—2022檢測過程中分別設(shè)陽性對照1、陽性對照2與陰性對照。10 結(jié)果判定1