瘤胃微生物總dna提取方法的研究進(jìn)展

腫瘤胃的微生態(tài)系統(tǒng)非常復(fù)雜，有各種復(fù)雜、多樣和不受影響的微生物，包括腫瘤細(xì)菌、原生動(dòng)物、細(xì)菌和厭倦感。根據(jù)研究，腫瘤胃中的細(xì)菌數(shù)量最大，腫瘤胃內(nèi)容物中的細(xì)菌數(shù)量達(dá)到10%。對(duì)于瘤胃微生物總DNA的提取，其最關(guān)鍵的一步是如何有效的裂解細(xì)胞。一般裂解瘤胃微生物細(xì)胞的方法包括以下幾種，一種是物理方法如玻璃珠研磨震蕩法1材料和方法1.1樣品采集采集瘤胃內(nèi)容物及瘤胃液，混勻，然后四層紗布過濾，濾液10000g離心5min，棄上清，沉淀用生理鹽水溶解，放置-70℃保存1.2細(xì)胞破碎方法的比較試驗(yàn)采用珠磨法等4種物理方法進(jìn)行瘤胃微生物的細(xì)胞破碎，采用SDS等9種化學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞破碎液的DNA提取，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4×9=36種提取方法的比較，每種方法均取樣品450μL。1.2.1冰選擇組合破碎材料見表1玻璃珠研磨法（簡(jiǎn)稱B）：樣品中加1g，直徑為150μm的玻璃珠，加抽提液，放置迷你珠磨儀上破碎，轉(zhuǎn)速46m/s,時(shí)間為20s,然后置于冰上10s,此步驟重復(fù)兩次，然后離心取上清。反復(fù)凍融法（簡(jiǎn)稱F）：樣品中加入抽提液，放置液氮中2min，然后迅速放置60℃水浴5min，此步驟重復(fù)3次，然后離心取上清。超聲波破碎法（簡(jiǎn)稱U）：樣品中加入抽提液后，放置超聲波破碎儀中，功率100w，破碎時(shí)間為5min，然后放置冰浴2min，此步驟重復(fù)兩次，然后離心取上清。液氮研磨法（簡(jiǎn)稱N）：先將樣品中加入適量液氮快速研磨，后加入抽提液，反復(fù)顛倒數(shù)次，然后離心取上清。1.2.2ctab提取液見表1，與物理方法相結(jié)合，對(duì)于第1、10、19、28方法，加900μLSDS提取液（100mMNaCl,500mMTrispH8.0,10%SDS），對(duì)于第5、14、23、32方法，加900μLCTAB提取液（100mMTris-HClpH8.0,100mMEDTApH8.0,100mM磷酸鈉pH8.0,1.5MNaCl,1%CTAB），對(duì)于第9、18、27、36方法，加900μL4MGTC提取液；對(duì)于第2、11、20、29方法，加600μLSDS,300μL飽和酚（pH8.0）；對(duì)于第3、12、21、30方法，加600μLSDS,300μL氯仿；對(duì)于第6、15、24、33方法，加600μLCTAB,300μL飽和酚（pH8.0）；對(duì)于第7、16、25、34方法，加600μLCTAB,300μL氯仿。以上各方法均是在樣品中加提取液后，進(jìn)行物理方法破碎處理瘤胃微生物細(xì)胞。1.2.3ph8.0,5.32,26.32先在樣品中加450μL溶液A(150mMNaCl,100mMEDTAPh8.0,15mg/mL溶菌酶），放置37℃水浴，2h進(jìn)行前處理，之后見表1，對(duì)于第4、13、22、31方法，加450μLSDS，對(duì)于第8、17、26、35方法，加450μLCTAB抽提液，然后再采用物理方法進(jìn)行處理。1.3-等體積酚-樣品將上述物理方法與化學(xué)方法處理后的樣品離心，6000轉(zhuǎn)/min，離心5min，取上清，加2mg/mL蛋白酶K100μL,65℃水浴，30min～1h，然后再加等體積酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）抽提兩次，12000g,4℃離心2min。取上清加2倍冷乙醇，沉淀1h,16000g,4℃離心10min，棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀，晾干，用TE(pH8.0，含10mg/μLRNase）溶解，放置37℃水浴30min。酚和氯仿抽提一次，12000g,4℃離心2min。上清加2倍體積乙醇，過夜。16000g,4℃離心10min，棄上清。70%乙醇洗滌沉淀，晾干，溶于TE(pH8.0）。1.4dns樣品的純度DNA樣品用泛基諾公司的普通型DNA純化試劑盒純化，樣品在-20℃保存。1.5d-濃度和電泳試驗(yàn)用紫外分光光度計(jì)于260、280nm波長(zhǎng)下測(cè)定粗提DNA與純化后DNA吸光值及濃度，計(jì)算出A1.6pcr擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)體系為25μL，模板為2μL。通用細(xì)菌引物：F275’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’與R14925’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)：94℃3min,94℃40s,54℃50s,72℃2min,35循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1純度和濃度檢測(cè)結(jié)果見表2由表2可以看出，粗提的DNA的OD2.2瘤胃微生物基因組dna片段分子量圖1、2、3、4分別為珠磨法、反復(fù)凍融法、液氮研磨法、超聲波法，且在這4種物理方法中采用不同化學(xué)提取液提取DNA的電泳圖。對(duì)不同方法提取的DNA樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)，上樣量均為8μl。圖1、2、3、4均顯示瘤胃微生物DNA片段分子量在20kb左右，表明已獲得較大片段的瘤胃微生物基因組DNA。由圖1可以看出，在珠磨法中，加入CTAB提取液得到的DNA的量明顯高于其它提取液，而且在加入CTAB提取液后，將樣品放置65℃水浴幾分鐘，提取DNA的效果會(huì)更好選取珠磨法和反復(fù)凍融法中部分樣品，經(jīng)過純化后電泳，從圖5中可以明顯看出，純化后的DNA結(jié)果較理想，條帶明亮，說明可用于以后的分子生物學(xué)操作。2.3粗提dna的純化以不同方法提取DNA純化處理后作為模板，可得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物。從圖6中可看出，不同方法粗提的DNA純化后作為模板，得到的PCR產(chǎn)物量不同。以珠磨法加CTAB提取液的方法得到的最多，而液氮研磨法與超聲波法得到的產(chǎn)物的量較少。3玻璃珠和反復(fù)凍融法提取環(huán)境微生物的最佳條件選擇從以上方法提取的效果來看，珠磨法與反復(fù)凍融法結(jié)合相應(yīng)的化學(xué)提取液，可以獲得比較完整的瘤胃微生物總DNA，并且效果要比液氮研磨法和超聲波法好。在珠磨法中，選用直徑為150μm的玻璃珠提取效果最佳，但是震蕩的時(shí)間不宜過長(zhǎng)，頻率不宜太高，如果時(shí)間過長(zhǎng)，震蕩幅度過大，有可能將大片段的DNA斷裂，增加DNA的斷片。反復(fù)凍融法在提取環(huán)境微生物及海洋微生