六、α-淀粉酶酶學(xué)性質(zhì)測定II

（米氏常數(shù)Km值的測定)

1.目的意義

由LeonorMichaelis和MaudMenten在1913年提出的米氏方程（Michaelis-MentenEquation）是酶學(xué)中表示整個(gè)反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的、表示一個(gè)酶促反應(yīng)的起始速度V與底物濃度[S]關(guān)系的方程。

米氏方程形式如下所示：其中，Vmax表示酶被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，Km值稱為米氏常數(shù)，是酶促反應(yīng)速度V為最大酶促反應(yīng)速度值一半時(shí)的底物濃度,即V=1/2Vmax時(shí),Km=[S]

。在酶促反應(yīng)中，底物在低濃度情況下，反應(yīng)相對(duì)于底物是一級(jí)反應(yīng)（firstorderreaction）；而當(dāng)?shù)孜餄舛忍幱谥虚g范圍時(shí)，反應(yīng)（相對(duì)于底物）是混合級(jí)反應(yīng)（mixedorderreaction）；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾訒r(shí)，反應(yīng)由一級(jí)反應(yīng)向零級(jí)反應(yīng)（zeroorderreaction）過渡；當(dāng)?shù)孜餄舛萚S]逐漸增大時(shí)，速度V相對(duì)于[S]的曲線為一雙曲線。下圖為米氏方程的模擬作圖：米氏常數(shù)的意義由米氏方程可知，當(dāng)反應(yīng)速度等于最大反應(yīng)速度一半時(shí),即V=1/2Vmax時(shí),Km=[S]。上式表示,米氏常數(shù)是反應(yīng)速度為最大值的一半時(shí)的底物濃度。因此,米氏常數(shù)的單位為mol/L(在本實(shí)驗(yàn)中單位為g/L)。不同的酶具有不同Km值，它是酶的一個(gè)重要的特征物理常數(shù)。Km值只是在固定的底物，一定的溫度和pH條件下，一定的緩沖體系中測定的，不同條件下具有不同的Km值。Km值表示酶與底物之間的親和程度：Km值大表示親和程度小，酶的催化活性低;Km值小表示親和程度大,酶的催化活性高。通過Km值的測定，可鑒定酶的各種底物，Km值最小者為酶最佳底物，即天然底物。2.實(shí)驗(yàn)原理底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響在酶濃度、pH、溫度等條件不變的情況下研究底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系。如右圖所示：在低底物濃度時(shí),反應(yīng)速度與底物濃度成正比，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)特征。當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到一定值，幾乎所有的酶都與底物結(jié)合后，反應(yīng)速度達(dá)到最大值（Vmax），此時(shí)再增加底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為零級(jí)反應(yīng)。

酶促反應(yīng)中的米氏常數(shù)的測定和Vmax的測定有多種方法。比如固定反應(yīng)中的酶濃度，然后測試幾種不同底物濃度下的起始速度，即可獲得Km和Vmax值。但直接從起始速度對(duì)底物濃度的圖中確定Km或Vmax值是很困難的，因?yàn)榍€接近Vmax時(shí)是個(gè)漸進(jìn)過程。因此，通常情況下，我們都是通過米氏方程的雙倒數(shù)形式來測定，即Lineweaver-Burkplot，也可稱為雙倒數(shù)方程(double-reciprocalplot)：

用1/V對(duì)1/[S]作圖，即可得到一條直線，該直線在Y軸的截距即為1/Vmax，在X軸上的截距即為1/Km的絕對(duì)值，斜率為Km/Vmax。如圖所示：Km=-1/x3.儀器設(shè)備3.1試劑10mg/ml可溶性淀粉1500ml0.005%碘液2000ml0.25M醋酸溶液0.4MpH6.0醋酸緩沖液3.2器材15ml大試管20支1ml移液管2支5ml移液管2支10ml移液管2支200ml燒杯2個(gè)100ml燒杯2個(gè)玻棒1支雙蒸水1瓶（50ml）比色皿1套（4個(gè)）、玻璃皿1套、洗瓶1個(gè)吸耳球1個(gè)記號(hào)筆1支試管架2個(gè)200μl-1000μl、20μl-200μl、0.5μl-10μl移液器各1支；小號(hào)、中號(hào)、大號(hào)槍頭各1盒（需滅菌）旋渦混合器1套（置于每組桌上）4.實(shí)驗(yàn)方法取一定量的酶（稀釋為10-6倍）；加入各種不同濃度的底物（如表所示）；在一定時(shí)間內(nèi)測定產(chǎn)物的量（30min）；建立x，y軸，作圖，建立回歸方程；在Y=0時(shí)，求其x值（即[S]）→Km；4.1測定—取12支試管，分別標(biāo)記，按照下表操作。編號(hào)123456789底物濃度[S]（mg·mL-1）46810121416182010mg/ml淀粉溶液（ml）0.40.60.81.01.21.41.61.82.0醋酸緩沖液（ml）2.62.42.22.01.81.61.41.21.0預(yù)熱40℃5minα-淀粉酶（ml）1反應(yīng)時(shí)間30min反應(yīng)終止各管加入0.25M醋酸10ml顯色反應(yīng)取1ml反應(yīng)液加入預(yù)先加入試管中的0.005%碘液中，振蕩混勻A(OD700nm)1/A1/[S](mg·ml-1)

注意：每組（不同底物濃度）都需要設(shè)置D0為對(duì)照，計(jì)算出U值。

chenhuicheng@4.2數(shù)據(jù)處理各管在700nm測定OD700nm值（注意，比色皿務(wù)必洗凈擦干）。由于光密度（OD700nm）與顯色，顯色與底物濃度成正比，反應(yīng)時(shí)間均為30min。計(jì)算1/V，以1/V為縱坐標(biāo)作圖。由于測定所用單位為mg·mL-1換算為Km