制備雞肉香精用的雞脂酶解溫和氧化條件研究

于靜洋陳皇女夏書(shū)芹張曉鳴(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.啟東市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，江蘇南通226200)天然熱反應(yīng)肉味香精秉承“味料同源”的理念[1]，憑借其天然營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味逼真的特點(diǎn)，沖擊著傳統(tǒng)合成香精的市場(chǎng)，成為現(xiàn)代調(diào)味品市場(chǎng)的主力軍。肉香味的形成機(jī)理十分復(fù)雜，其反應(yīng)包括氨基與羰基的美拉德反應(yīng)、糖降解、肽及氨基酸降解、脂質(zhì)降解，以及脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的反應(yīng)等。不同種類(lèi)肉制品的特征風(fēng)味是由相對(duì)應(yīng)的不同動(dòng)物脂肪氧化降解得到的產(chǎn)物所提供的[2]，所以，雞脂的氧化降解對(duì)于雞肉特征風(fēng)味的形成尤為重要。直接添加未氧化的脂肪于熱反應(yīng)體系中，脂肪氧化程度低，難以充分轉(zhuǎn)化為特征香味物質(zhì)，從而導(dǎo)致肉特征風(fēng)味不明顯。因此，在肉味香精制造過(guò)程中添加預(yù)先氧化的脂肪，既可減少脂肪用量,也可增強(qiáng)肉味香精的特征風(fēng)味[3]。很多研究[4-6]報(bào)道直接采用原料雞脂進(jìn)行加熱氧化處理來(lái)制備熱反應(yīng)雞肉香精，可以有效提高雞脂香。但是，為保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，目前工業(yè)化生產(chǎn)熱反應(yīng)雞肉香精多采用商用精煉雞脂作為提供雞肉特征風(fēng)味的原料，因其中含大量抗氧化劑，精煉雞脂性質(zhì)穩(wěn)定易于運(yùn)輸保存。但對(duì)于加熱氧化處理卻存在一定困難，低溫加熱難以使其氧化，高溫加熱則不易控制且易產(chǎn)生酸敗異味。目前，關(guān)于雞脂氧化的研究，文獻(xiàn)[7-10]報(bào)道通常以現(xiàn)炸鮮雞脂為原料，但是鮮雞脂質(zhì)量不易控制，工業(yè)上難以用其批量生產(chǎn)雞肉香精。為保證質(zhì)量穩(wěn)定，工業(yè)生產(chǎn)常采用商用精煉雞脂，但其氧化程度難以控制。本研究基于生物酶解技術(shù)，擬將商用精煉雞脂酶解后再適度溫和氧化而產(chǎn)生雞肉特征風(fēng)味前體，進(jìn)而制備熱反應(yīng)雞肉香精，期望能制備出與天然清燉雞湯具有非常高相似度的雞肉香精產(chǎn)品。1材料與方法1.1材料與儀器雞脂(抗氧化劑VE含量為0.3g/kg·雞脂)：安徽牧洋油脂有限公司；脂肪酶：1.0×104U/g，安徽強(qiáng)旺生物工程有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、p-茴香胺、異辛烷、乙醇、酚酞等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超級(jí)恒溫循環(huán)槽：MP501A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯式機(jī)械攪拌器：RW20型，德國(guó)IKA公司；pH計(jì)：DELTA320型，瑞士MettlerToledo公司；玻璃酶反應(yīng)器：500mL型，湖景玻璃儀器廠；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：SCIONSQ-456-GC型，德國(guó)Bruker公司。1.2試驗(yàn)方法1.2.1雞脂酶解-溫和氧化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)稱取一定量商用雞脂于酶反應(yīng)器中，根據(jù)不同底物濃度及pH要求添加磷酸鹽緩沖溶液，以400r/min均勻攪拌，添加適量脂肪酶，在超級(jí)恒溫循環(huán)槽中酶解-溫和氧化；反應(yīng)結(jié)束后，80℃加熱5min滅酶。(1)溫度：控制原料商用雞脂底物濃度為50%，每克雞脂中添加75U脂肪酶，調(diào)節(jié)pH為8.0，分別在35，40，45，50，55，60℃條件下酶解4h，測(cè)定不同酶解溫度下的雞脂脂解率，研究溫度對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響。(2)pH：控制原料商用雞脂底物濃度為50%，每克雞脂中添加75U脂肪酶，調(diào)節(jié)pH分別為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，在40℃條件下酶解4h，測(cè)定不同pH環(huán)境下的雞脂脂解率，研究pH對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響。(3)酶添加量：控制原料商用雞脂底物濃度為50%，在pH8.0、40℃條件下，每克雞脂中分別添加15，30，45，60，75，90U脂肪酶酶解4h，測(cè)量酶添加量不同時(shí)的雞脂脂解率，研究酶添加量對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響。(4)底物濃度：控制原料商用雞脂底物濃度分別為30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，每克雞脂添加60U脂肪酶，在pH8.0、40℃條件下酶解4h，測(cè)量不同底物濃度的雞脂脂解率，研究底物濃度對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響。(5)時(shí)間：控制原料商用雞脂底物濃度為30%，每克雞脂中添加60U脂肪酶，在pH8.0、40℃條件下，分別酶解3，4，5，6，7，8，9h，測(cè)量不同酶解時(shí)間的雞脂脂解率，研究時(shí)間對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響。1.2.2雞脂高溫氧化稱取一定量商用雞脂于四口燒瓶中，安裝機(jī)械攪拌器、水銀溫度計(jì)、冷凝管，同時(shí)連接空氣壓縮機(jī)，以25L/h流量通入空氣，置于150℃油浴中加熱1.5h，氧化后迅速冷卻。1.2.3美拉德反應(yīng)制備雞肉香精將雞骨酶解物、雞脂、半胱氨酸、還原糖以及其他配料、香辛料，按照一定比例放入美拉德反應(yīng)瓶?jī)?nèi)持續(xù)均勻攪拌，在pH6.0、100℃條件下反應(yīng)60min；熱反應(yīng)結(jié)束后，放入冰水浴中迅速冷卻，常溫下過(guò)夜熟化，-18℃冷凍保存?zhèn)溆谩?.2.4定量感官評(píng)定邀請(qǐng)15名經(jīng)驗(yàn)豐富的感官評(píng)定員(5位男性，10位女性，年齡20～50歲)，基于ISO標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)，充分討論后針對(duì)雞肉香精中雞脂風(fēng)味品質(zhì)確定一致的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[11]，確定以雞脂香、油膩味為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)雞肉香精進(jìn)行定量描述分析。按照1∶20的質(zhì)量比將雞肉香精稀釋，在60℃水浴中保溫10min后進(jìn)行感官評(píng)定。風(fēng)味強(qiáng)度采用九點(diǎn)法打分(1：極弱；9：極強(qiáng))。雞肉香精風(fēng)味特性描述詞及其定義見(jiàn)表1。表1雞肉香精風(fēng)味特性描述詞及其定義Table1Maintermsanddefinitionusedforprofilingtasteandaromaofchickenflavor1.2.5雞脂理化指標(biāo)測(cè)定(1)過(guò)氧化值(PV)：按GB/T5538—2005執(zhí)行。(2)酸值(AV)：按GB/T5530—2005執(zhí)行。(3)茴香胺值(p-AV)：按GB/T24304—2009執(zhí)行。(4)皂化值(Is)：按GB/T5534—2008執(zhí)行。(5)脂解率：按式(1)計(jì)算。(1)式中：c——脂解率，%；AV1——酶解前酸值(以NaOH計(jì))，mg/g；AV2——酶解后酸值(以NaOH計(jì))，mg/g；Is——皂化值(以NaOH計(jì))，mg/g。1.2.6清燉雞湯的制備將整雞除掉頭、尾、內(nèi)臟后，洗凈、切塊，稱取500g于砂鍋中，加水2000g、鹽10g，小火燉煮2h后，立即取中層雞湯200mL于密封瓶中，冷藏。1.2.7氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析(GC-MS)(1)取5.0mL雞脂樣品添加4μL0.62μg/μL1,2-二氯苯甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)。(2)SPME條件：60℃下吸附30min，250℃下解吸8min。(3)GC條件：毛細(xì)管色譜柱CP-WAX(30m×0.25mm×0.25μm)；載氣(He)流速1.8mL/min，不分流；起始柱溫40℃，保持3min，先以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，保持7min。(4)MS條件：電子轟擊電離源EI，電子能量70eV，發(fā)射電流35μA，離子源溫度200℃，接口溫度250℃，檢測(cè)器電壓350V，掃描范圍35～450amu[12]11。1.2.8氣相色譜質(zhì)譜—嗅聞系統(tǒng)聯(lián)用分析(GC-MS-O)采用GC-MS對(duì)樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，查閱相關(guān)文獻(xiàn)鑒定揮發(fā)性成分以及部分標(biāo)準(zhǔn)物的可能氣味，培訓(xùn)測(cè)評(píng)員讓其提前熟知。采用檢測(cè)頻率法對(duì)樣品中的特征風(fēng)味活性成分進(jìn)行檢測(cè)，由5位測(cè)評(píng)員進(jìn)行嗅聞并記錄。同一時(shí)間有3位以上測(cè)評(píng)員可以感覺(jué)到時(shí)，則記錄該氣味描述及其保留時(shí)間[12]13。2結(jié)果與分析2.1雞脂酶解—溫和氧化工藝優(yōu)化2.1.1溫度對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響從圖1(a)可知，溫度對(duì)雞脂酶解效果有明顯影響，溫度從35℃升至60℃時(shí)，雞脂脂解率呈先上升再下降趨勢(shì)。40℃時(shí)，雞脂脂解率最高，達(dá)到37.72%，40℃升至60℃時(shí)，脂解率從37.72%迅速降至0.07%。研究[13]208表明，雞脂酶解最適溫度為40℃，溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致脂肪酶活性下降，尤其高溫條件下脂肪酶易失活。從圖1(b)可知，不同溫度下的酶解雞脂對(duì)美拉德產(chǎn)物風(fēng)味也有明顯影響。40℃的酶解雞脂制得的美拉德產(chǎn)物雞脂香最濃，油膩味較低。55，60℃的酶解雞脂制得的美拉德產(chǎn)物油膩味過(guò)重，缺乏雞脂香氣，整體風(fēng)味不協(xié)調(diào)。因此，在40℃條件下酶解雞脂最為合適。2.1.2pH對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響由圖2可知，pH對(duì)雞脂脂解率有明顯影響。pH8.0時(shí)，雞脂酶解率最高為37.72%；pH9.0時(shí)，雞脂脂解率最低，僅有11.33%。這與不同pH環(huán)境下脂肪酶活性不同有關(guān)，過(guò)高或者過(guò)低的pH環(huán)境均會(huì)降低脂肪酶活性[13]205。感官結(jié)果也顯示pH8.0環(huán)境下獲得的酶解雞脂制得的雞肉香精雞脂香味最強(qiáng)、油膩味較低，整體風(fēng)味更為逼真；雞脂酶解pH為5.0時(shí)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物雞脂香不足，并有腥異味；pH9.0時(shí)，油膩味過(guò)重，掩蓋了雞脂香，且焦糊味較重。綜合看來(lái)，pH8.0是雞脂酶解的最適pH環(huán)境。圖1溫度對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響圖1Effectsofenzymatictemperatureonenzymatichydrolysisandapplicationofchickenfat(n=2)圖2pH對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響圖2EffectsofenzymaticpHonenzymatichydrolysisandapplicationofchickenfat(n=2)2.1.3酶添加量對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響從圖3可知，隨著脂肪酶含量的增加，雞脂脂解率總體呈逐漸上升趨勢(shì)。在每克雞脂中，酶添加量從15U上升至90U，雞脂脂解率幾乎呈直線上升；但酶添加量>60U后，脂解率變化趨勢(shì)變緩。根據(jù)酶的作用機(jī)制[13]204，通常認(rèn)為當(dāng)酶濃度<2.1.4底物濃度對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響由圖4可知，隨著底物濃度的增加，雞脂脂解率逐漸降低。底物濃度從30%升至90%，雞脂脂解率從42.12%降至29.26%。酶解反應(yīng)需要水來(lái)維持酶分子構(gòu)象，在油與水界面處的酶反應(yīng)活性最大，因此，在雞脂底物濃度不斷增大的過(guò)程中，體系中的水分相對(duì)降低，導(dǎo)致水分與酶接觸的充分程度降低，從而降低酶活性，相同時(shí)間內(nèi)雞脂脂解程度降低[14]。同時(shí)，隨著雞脂酶解底物濃度的增加，后期美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的雞脂香逐漸降低、油膩味逐漸升高，但總體變化不明顯。低于30%的底物濃度可能會(huì)有更高的脂解率，但生產(chǎn)效率較低，因此，雞脂酶解的最適底物濃度選擇為30%。2.1.5時(shí)間對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響從圖5可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，雞脂脂解率逐漸升高。反應(yīng)初期，雞脂脂解率增加較快，酶解時(shí)間從3h升至6h，雞脂脂解率從35.84%升至45.18%。反應(yīng)后期，脂解率增長(zhǎng)緩慢，酶解時(shí)間從6h升至9h，脂解率僅從45.18%升至46.19%。這是因?yàn)殡S著反應(yīng)進(jìn)行，底物濃度逐漸降低，酶活性也逐漸降低，從而導(dǎo)致反應(yīng)速率下降。同時(shí)，逐漸增多的酶解產(chǎn)物會(huì)占領(lǐng)酶與底物的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制酶與底物結(jié)合，或者產(chǎn)物占據(jù)了底物的重要催化部位，阻礙酶發(fā)揮催化作用[15]。感官評(píng)定結(jié)果表明雞脂酶解時(shí)間對(duì)美拉德產(chǎn)物雞脂香的影響與雞脂脂解率的變化較為一致。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的雞脂香逐漸增強(qiáng)，同時(shí)油膩味也逐漸降低，總體風(fēng)味濃郁度與逼真度逐漸升高。前6h風(fēng)味變化較為明顯，后3h風(fēng)味變化緩慢。因此，雞脂酶解的最佳時(shí)間選擇為6h。圖3酶添加量對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響圖3Effectsoflipaseconcentrationonenzymatichydrolysisandapplicationofchickenfat(n=2)圖4底物濃度對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響圖4Effectsofsubstrateconcentrationonenzymatichydrolysisandapplicationofchickenfat(n=2)圖5時(shí)間對(duì)雞脂酶解及應(yīng)用效果的影響圖5Effectsofenzymatictimeonenzymatichydrolysisandapplicationofchickenfat(n=2)綜上所述，最優(yōu)雞脂酶解工藝條件為：底物濃度30%，每克雞脂中添加60U脂肪酶，在40℃、pH8.0條件下，酶解6h。此時(shí)獲得的雞脂脂解率為45.18%，且由其制備的雞肉香精雞脂香濃郁，油膩味較弱。2.2不同處理雞脂的氧化程度和應(yīng)用效果對(duì)比2.2.1氧化程度分析脂肪的氧化程度常用PV、AV以及p-AV值表示。其中，PV值表征雞脂氧化的初級(jí)產(chǎn)物氫過(guò)氧化物含量，經(jīng)過(guò)熱解可提供雞肉香味物質(zhì)或其前體物；AV值表征羧酸類(lèi)化合物含量，若AV值過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的酸敗味和焦臭味；p-AV值表征羰基化合物特別是不飽和醛類(lèi)的含量，其含量高低對(duì)雞肉風(fēng)味具有重要影響[16]。分別測(cè)定原料商用雞脂、采用2.1最優(yōu)酶解—溫和氧化工藝條件得到的雞脂和高溫加熱氧化雞脂的PV、AV以及p-AV，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，原料商用雞脂的PV、AV和p-AV均較低。經(jīng)過(guò)高溫加熱氧化后，雞脂的PV明顯升高至246.25meq/kg，AV變化不明顯。雖然p-AV升高可為后續(xù)美拉德反應(yīng)提供更為豐富的風(fēng)味前體，但過(guò)高的PV說(shuō)明此時(shí)油脂已經(jīng)發(fā)生酸敗。經(jīng)過(guò)酶解—溫和氧化之后，雞脂的PV和p-AV有一定升高，AV顯著升高至72.65mgNaOH/g，這是由于酶的高效催化，脂肪水解成大量脂肪酸，部分脂肪酸氧化生成氫過(guò)氧化物與醛、酮等二級(jí)產(chǎn)物。2.2.2應(yīng)用效果評(píng)價(jià)以上述3種不同氧化程度雞脂為原料，分別制備美拉德反應(yīng)雞肉香精MCF1(原料商用雞脂)、MCF2(最優(yōu)酶解—溫和氧化雞脂)、MCF3(高溫加熱氧化雞脂)，并對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)定分析，結(jié)果見(jiàn)表3。表2不同雞脂氧化狀態(tài)分析Table2Oxidationstateanalysisofdifferentchickenfat(n=3)表3不同雞脂制備的雞肉香精感官評(píng)定分析Table3Sensoryevaluationresultsofchickenflavorwithdifferentchickenfat(n=3)從表3可知，MCF1雞脂香一般、沒(méi)有酸敗味，但油膩味過(guò)重；MCF3雞脂香和油膩味雖有略微改善，但酸敗味明顯；MCF2雞脂香濃郁，油膩味與酸敗味均有明顯改善。上述結(jié)果表明，雞脂的氧化程度與狀態(tài)對(duì)熱反應(yīng)雞肉香精的風(fēng)味品質(zhì)具有重要影響。商用精煉雞脂經(jīng)過(guò)酶解后，能得到適度氧化，形成雞肉特征風(fēng)味前體，熱反應(yīng)雞肉香精風(fēng)味得到明顯改善。2.3基于雞湯風(fēng)味的相似性分析采用GC-MS-O技術(shù)，基于天然清燉雞湯中揮發(fā)性特征風(fēng)味成分和相對(duì)含量鑒定，分析比較雞肉香精MCF1、MCF2與MCF3的揮發(fā)性特征風(fēng)味成分與香氣風(fēng)格，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知，清燉雞湯與3種雞肉香精中共檢測(cè)出20種雞肉揮發(fā)性特征風(fēng)味成分。飽和醛類(lèi)物質(zhì)多具有青草香、花香等氣味，其含量隨著雞脂氧化程度的升高而增加，MCF3樣品以高溫加熱氧化雞脂為原料，其中飽和醛類(lèi)物質(zhì)含量明顯高于MCF1和雞湯的，因此有異味產(chǎn)生。不飽和醛類(lèi)物質(zhì)多具有雞脂香等氣味，MCF1中的雞脂未經(jīng)氧化處理，不飽和醛類(lèi)物質(zhì)含量明顯低于雞湯中含量，表現(xiàn)為雞脂香不濃郁。MCF2樣品以酶解-溫和氧化雞脂為原料，醛類(lèi)物質(zhì)含量適中，公認(rèn)的雞肉特征風(fēng)味成分(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛分別為193.37，30.69μg/100g，與雞湯的最為接近，雞脂香濃郁、無(wú)異味，逼真度最高。呋喃、吡啶、噻吩、噻唑等雜環(huán)類(lèi)物質(zhì)可能都是由脂肪氧化降解產(chǎn)物與美拉德反應(yīng)相互作用形成的，是肉類(lèi)食品中重要的風(fēng)味成分[13]321[17]，其中2-戊基吡啶、2-乙酰噻唑等含量都隨著雞脂氧化程度升高呈先增加后減少的趨勢(shì)，MCF2中含量最多，也與雞湯中含量接近，說(shuō)明經(jīng)過(guò)酶解-溫和氧化的雞脂參與美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的雞肉香精風(fēng)味最佳。表4不同氧化程度雞脂制備的雞肉香精與清燉雞湯的揮發(fā)性成分比較?Table4Comparisonofvolatilecompoundscontentin3differentchickenflavorsandchickenbroth?--代表樣品中未檢出。硫醇及硫醚類(lèi)物質(zhì)具有肉味、硫味、咖啡等風(fēng)味，是肉類(lèi)特征風(fēng)味物質(zhì)，但是肉香中的硫酯、硫醚類(lèi)物質(zhì)閾值較低[13]323，含量過(guò)高反而會(huì)形成硫臭味，MCF1樣品中雙(2-甲基-3-呋喃)二硫醚與2-甲基-3-呋喃硫醇等物質(zhì)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雞湯中含量，表現(xiàn)出明顯硫臭味。MCF2中含硫成分含量適中，肉香味醇厚；MCF3中含硫化合物含量較低，肉味不足。本研究基于上述20種檢測(cè)到的雞肉特征風(fēng)味成分，計(jì)算出雞肉香精與清燉雞湯中風(fēng)味成分含量的比值，繪制了雞肉特征風(fēng)味相似度雷達(dá)圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6可知，MCF2風(fēng)味成分曲線與清燉雞湯重合度最高。經(jīng)過(guò)pearson相關(guān)性分析，MCF2與清燉