7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸的合成研究進展

perrin活性物質已經(jīng)發(fā)展到第四代。抗癲癇藥物的數(shù)量正大量增加。7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸(7-ADCA)是口服頭孢類藥物重要的中間體,主要用于頭孢氨芐、頭孢羥氨芐、頭孢拉定等抗生素的合成。20世紀70年代,出現(xiàn)了以青霉素為原料化學法合成7-ADCA的工藝路線。近年來,隨著生物合成技術的進步,對生物酶的研究不斷深入,相關報道層出不窮。另外,對微生物菌種進行細胞水平、分子水平等不同層次的設計,構建具有特殊功能的“工程菌”,可以通過發(fā)酵直接得到7-ADCA。化學法合成過程工藝復雜并且環(huán)境污染嚴重,生物法合成7-ADCA生產(chǎn)成本低且環(huán)境友好。隨著生物合成技術的突飛猛進,不久勢必取代化學法用于工業(yè)生產(chǎn)。2化學法合成7-ADCA在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用,以青霉素G鉀鹽為原料,分三步反應完成第一步是青霉素在氧化劑的作用下氧化成青霉素亞砜。有的氧化劑制備成本高、處理過程危險,有的氧化劑作用后所得最終產(chǎn)品質量差,因此對氧化劑性能的研究成為改進氧化過程的關鍵第二步是青霉素亞砜擴環(huán)重排為7-苯乙酰胺基法乙酰氧基頭孢烷酸(又稱頭孢菌素G)。為了防止脫羧或其它副反應的發(fā)生,在擴環(huán)前需要將青霉素亞砜通過酯化反應轉化為青毒素亞砜酯。酯化劑的選擇不僅影響擴環(huán)、水解反應的產(chǎn)率而且也將影響到擴環(huán)反應的選擇性。擴環(huán)反應以酸為催化劑在有機溶劑中進行,對擴環(huán)反應的研究集中在反應時間、溫度、溶劑選擇以及高效催化劑的尋求等方面。擴環(huán)反應以后,將頭孢烷酸酯轉化成游離酸,再直接水解脫去保護基團得到頭孢菌素G。第三步裂解頭孢菌素G,脫去7位上的苯乙?；?-ADCA。一般采用五氯化磷、甲醇反應生成亞胺酯,然后水解得到7-ADCA。通過調節(jié)溶液的pH值,結晶得到7-ADCA固體產(chǎn)品。目前生物酶裂解頭孢菌素G的工藝研究成熟并廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中,化學法裂解已經(jīng)被淘汰。33.1酶法合成7-ADCA采用生物酶催化裂解和擴環(huán)反應受到各國醫(yī)藥行業(yè)的廣泛重視。首先是青霉素酰化酶在生產(chǎn)中大規(guī)模裂解青霉素生產(chǎn)6-APA取得成功。由于?；笇Φ孜锏膶Ｒ恍灾饕Q于側鏈結構,因此青霉素?；敢部梢杂糜诹呀忸^孢菌素G制備7-ADCA。青霉素亞砜酯擴環(huán)是制備頭孢菌素G是7-ADCA合成工藝中的關鍵。青霉素擴環(huán)酶成為繼青霉素?；钢蟮挠忠粋€研究熱點。3.1.1青霉素酰化酶青霉素?；甘且环N雙向作用酶,國內外對青霉素?；傅男再|及在生產(chǎn)中的應用已經(jīng)進行了充分的研究為了提高青霉素?；傅陌胨テ?、循環(huán)使用和防止生產(chǎn)中大分子物質過敏,對酰的固定化及酶反應器形式方面的研究受到廣泛關注。傳統(tǒng)的酰固定化3.1.2擴環(huán)酶催化擴環(huán)反應的酶被稱為脫乙酰氧基頭孢菌素C合成酶(DAOCS),也叫擴環(huán)酶。1976年Kohsaka和Demain首先對低等小型絲狀真核生物頂頭孢的無細胞提取液進行生物學系統(tǒng)擴環(huán)反應,取得了成功。1987年Baldwin等研究發(fā)現(xiàn)所有的擴環(huán)酶都顯示出對底物青霉素側鏈性質的高度專一性。除了青霉素N外,常見的異青霉素N、青霉素G或6-氨基頭孢酶烷酸(6-APA)都不能作為底物3.2發(fā)酵法合成7-ADCA對青霉素和頭孢菌素C生物合成的途徑研究表明,在低等真核和原核產(chǎn)生菌中,β-內酰胺抗生素的生物合成途徑基本相同,都是以形成LLD-ACV三肽開始,經(jīng)過環(huán)化、差向異構化得到分支底物異青霉素N,經(jīng)不同的合成酶催化,形成不同的β-內酰胺抗生素-青霉素、頭孢菌素C和頭霉素。在合成過程中鑒別、確定影響合成的限速步驟,增加微生物中編碼該酶的基因表達量提高催化該反應的酶產(chǎn)量,可以提高發(fā)酵過程中7-ADCA的產(chǎn)量。產(chǎn)黃青霉和真菌頂頭孢是自然界中產(chǎn)生青霉素和頭孢菌素的主要途徑,它本身并不產(chǎn)生差向異構酶和擴環(huán)酶,發(fā)酵后積累大量青霉素G和V,如果將擴環(huán)酶的基因構建成不同的質粒,并轉化到產(chǎn)黃青霉中,使轉化菌株對常見的青霉素具有擴環(huán)作用,可以在發(fā)酵過程中形成頭孢環(huán),經(jīng)過適當?shù)男揎椇蟮玫?-ADCA。擴環(huán)基因通常從棒狀鏈霉菌中獲得,棒狀鏈霉菌擴環(huán)基因只能識別青霉素N,但對其編碼擴環(huán)的基因進行修飾后,使得表達的擴環(huán)酶的底物專一性改變,可識別不同的青霉素衍生物。己二?；?6-APA被認為是擴環(huán)酶的高效底物。Merck公司通過改造產(chǎn)黃青霉菌株,增加編碼接己二?；?6-APA底物擴環(huán)酶活性的基因拷貝數(shù),向上述菌種培養(yǎng)基中加入己二酸或者己二酸鹽,發(fā)酵得到己二?；?6-APA,可以同時將己二?；?6-APA擴環(huán)成己二?；?7-ADCA;然后在己二酰基?；傅淖饔孟氯サ艏憾；鶄孺溕?-ADCA真菌頂頭孢是自然界中產(chǎn)生青霉素和頭孢菌素的主要途徑。細菌棒狀鏈霉菌中羥化和擴環(huán)兩種活性由兩個獨立的酶承擔,編碼擴環(huán)酶基因CefE只有擴環(huán)活性而無羥化活性。而真菌頂頭孢的擴環(huán)酶是雙功能酶,編碼擴環(huán)酶的基因CefE和編碼羥化的基因CefEF同時存在,具有擴環(huán)和羥化兩種不同的酶促活性。擴環(huán)酶基因CefE對青霉素N擴環(huán)生成去乙酰氧基頭孢菌素C(DAOC),斷側鏈得7-ADCA。羥化酶基因CefEF的存在對青霉素N擴環(huán)生成去乙?；^孢菌素C(DAC),斷側鏈得7-ACA。發(fā)酵頂頭孢后得到頭孢菌素C、DAOC和DAC混合物。為了提高發(fā)酵頂頭孢DAOC的產(chǎn)量,需要斷裂頂頭孢中的CefEF基因,使其羥化酶失活,阻止發(fā)酵過程中頭孢菌素C的生成而積累大量的青霉素N。然后再轉錄棒狀鏈霉菌中的CefEF基因,發(fā)酵后將有75%~80%的β-內酰胺物質轉化為DAOC。DAOC經(jīng)過兩步酶法分別由D-氨基酸氧化酶(DAO)和戊二?；；?GLA)斷側鏈生成7-ADCA3通過對生物酶的研究和改進,將其用于催化7-ADCA的合成反應,減少和避免有機