浮游植物葉綠素a測(cè)定方法的比較研究

a芽、浮游生物密度和藻類分類是當(dāng)前浮游生物監(jiān)測(cè)的重要參數(shù)，對(duì)監(jiān)測(cè)和監(jiān)測(cè)洪水流量提供了最直接、最有效的數(shù)據(jù)。浮游植物密度和分類計(jì)數(shù)的分析難度大,對(duì)專業(yè)要求較高,分析進(jìn)度緩慢。相對(duì)而言,葉綠素a含量的測(cè)定方法較為簡(jiǎn)單,其中分光光度法應(yīng)用最為廣泛?！端蛷U水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版增補(bǔ)版)采用分光光度法作為葉綠素a的常規(guī)監(jiān)測(cè)方法,以90%丙酮為溶劑研磨提取葉綠素a。該方法充分破碎藻類細(xì)胞壁,對(duì)葉綠素a的提取效率高。但研磨過(guò)程中葉綠素a容易發(fā)生光降解使結(jié)果偏低,提取過(guò)程繁瑣,人為誤差較大。此外,研磨過(guò)程花費(fèi)較多時(shí)間,與丙酮的接觸時(shí)間長(zhǎng),不利于操作人員的健康。不少研究從提取溶劑本文研究了3種濾膜(乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜和玻璃纖維濾膜)對(duì)葉綠素a測(cè)定結(jié)果的影響,比較了丙酮浸提法、丙酮研磨法、乙醇法和熱乙醇法的方法穩(wěn)定性和可替代性。1材料和方法1.1碳酸鎂懸濁液水樣取自中山市逸仙湖公園的人工湖湖水,樣品采集后立即加入1%碳酸鎂懸濁液(1L水樣加1%碳酸鎂懸濁液1ml),以防酸化引起色素波長(zhǎng)偏移。3種濾膜:孔徑0.45μm的乙酸纖維濾膜(上海興亞)、孔徑0.45μm的混合纖維濾膜(天津津騰)、孔徑0.7μm的進(jìn)口玻璃纖維濾膜(WathmanGF/F);孔徑0.45μm的聚四氟乙烯針式抽濾器;玻璃研缽。1.2江蘇ws型真空泵(天津奧特賽恩AP-01D)、臺(tái)式低速離心機(jī)(江蘇恒豐TD5A-WS型)、恒溫水浴鍋(上海一恒HWS-24)、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海亞研電子UV1900PC)、醫(yī)用保溫冰箱(海爾DW-25W198)等。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1%丙酮實(shí)驗(yàn)經(jīng)24h浸泡活化的乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜和玻璃纖維濾膜放入冰箱低溫干燥,分別放入10ml試管中,加入90%丙酮10ml,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。暗處浸提24h后,以90%丙酮作空白對(duì)照,測(cè)定上清液在630nm、645nm、663nm、750nm處的吸光值,比較3種濾膜對(duì)90%丙酮吸光度的影響。1.3.2不同溶劑提取液對(duì)樣品葉綠素a含量的影響分別用乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜和玻璃纖維濾膜過(guò)濾同一水樣丙酮研磨法是樣品濾膜剪碎后,加入90%丙酮、適量碳酸鎂充分研磨,于暗處浸提24h以90%丙酮為溶劑的方法,分別在630nm、645nm、663nm、750nm下測(cè)定提取液的吸光度,計(jì)算樣品葉綠素a含量1.3.3濾膜冷凍與否對(duì)乙醇法測(cè)定葉綠素a含量的影響將一組濃縮樣品的濾膜于-20℃下冷凍8h后,加入90%乙醇10ml,暗處萃取浸提24h,另一組濃縮樣品的濾膜直接加入90%乙醇10ml,暗處萃取浸提24h,每組實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行,比較濾膜冷凍與否對(duì)乙醇法測(cè)定葉綠素a含量的影響。1.4數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)用SPSS(12.0中文版本)進(jìn)行顯著性分析(0.01<P<0.05差異顯著)。2結(jié)果和討論2.1分光光度計(jì)算c乙酸纖維濾膜和混合纖維濾膜均可溶解于90%丙酮。玻璃纖維濾膜吸水膨脹,但不發(fā)生溶解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三種濾膜的吸光度波動(dòng)小于0.0010,在分光光度計(jì)的光度波動(dòng)范圍內(nèi)(0.001Abs),750nm處吸光度符合小于0.005的要求(見(jiàn)表1)。經(jīng)檢驗(yàn),三種濾膜的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性差異(P>0.05),對(duì)90%丙酮吸光度測(cè)定沒(méi)有影響。(表2)由于研磨時(shí)加入的碳酸鎂在傾倒上清液時(shí)容易再懸浮,使得上清液比色時(shí)750nm處吸光度超過(guò)0.005。即便用滴管小心吸取上清液,也容易帶出碳酸鎂。張幗等人2.2丙酮浸提法和丙酮研磨法的比較如圖1所示,分別用乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜、玻璃纖維濾膜過(guò)濾同一水樣,三種濾膜對(duì)丙酮浸提法和丙酮研磨法測(cè)定的葉綠素a含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。盡管乙酸纖維濾膜和混合纖維濾膜能溶解在丙酮中,但在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響,所以可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室獲得便利及價(jià)格來(lái)選擇使用以上三種濾膜進(jìn)行葉綠素a測(cè)定,這與林少君等人在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上,丙酮浸提法和丙酮研磨法測(cè)定葉綠素a無(wú)顯著差異,兩種方法可以相互替代。但丙酮研磨法測(cè)定的結(jié)果稍低,誤差較大,可能是研磨步驟較多,多次轉(zhuǎn)移,造成樣品損失。與丙酮浸提法測(cè)定結(jié)果的平均值比較,研磨法所造成的損耗率為16.68~41.10%,平均值為32.91%。一些研究者2.3乙醇法替代熱乙醇法熱乙醇法多了80℃水浴2min的步驟,測(cè)定結(jié)果和乙醇法的沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。熱乙醇法的平行性差,偏差較大(圖2),加熱過(guò)程中80℃水浴較難控制,容易發(fā)生樣品噴發(fā)而造成樣品損失,建議用乙醇法直接替代熱乙醇法測(cè)定葉綠素a含量。楊玉珍等人如圖3所示,濾膜富集樣品后,是否在-20℃下冷凍8h對(duì)乙醇法測(cè)定葉綠素a含量沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。未冷凍直接浸提只是利用乙醇溶液滲透到藻細(xì)胞內(nèi)提取葉綠素a。-20℃下冷凍8h后再用90%乙醇萃取,冷凍再融解的過(guò)程可以引起細(xì)胞溶漲2.4不同提取方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析經(jīng)顯著性分析,本實(shí)驗(yàn)中丙酮浸提法與乙醇法的測(cè)定結(jié)果有顯著性差異(P<0.05),其它方法的測(cè)定結(jié)果并無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖4)。相對(duì)于丙酮研磨法和熱乙醇法,丙酮浸提法和乙醇法的標(biāo)準(zhǔn)偏差較小,前處理步驟簡(jiǎn)化,只需將濾膜放入離心管,加入萃取劑后靜置浸提24h,整個(gè)提取過(guò)程沒(méi)有溶液的轉(zhuǎn)移,操作簡(jiǎn)便,轉(zhuǎn)移損失更小。從統(tǒng)計(jì)意義上來(lái)說(shuō),丙酮浸提法的測(cè)定結(jié)果普遍比乙醇法高,說(shuō)明90%丙酮提取浮游植物的葉綠素a較90%乙醇提取更完全。這是因?yàn)楸拇┩感詮?qiáng),容易滲透到浮游植物細(xì)胞中,而乙醇的性質(zhì)決定了其萃取效率不高由于丙酮法作為標(biāo)準(zhǔn)方法被長(zhǎng)期使用,為了歷史數(shù)據(jù)的可比性,可以使用步驟簡(jiǎn)化但更安全的丙酮浸提法。乙醇法無(wú)毒害,結(jié)果可靠,建議在水體浮游植物葉綠素a監(jiān)測(cè)工作中推廣。3葉綠素a含量3.1乙酸纖維濾膜、混合纖維濾膜、玻璃纖維濾膜對(duì)90%丙酮的吸光度影響很小,對(duì)丙酮浸提法與研磨法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響,可以根據(jù)需要選擇以上三種濾膜。3.2丙酮浸提法與研磨法測(cè)定的葉綠素a含量無(wú)顯著差異,可相互替換,但丙酮研磨法的平均損耗率為32.91%,誤差較大。3.3乙醇法與熱乙醇法測(cè)定的葉