大口黑鱸虹彩病毒病的研究進展

大口黑魚（俗稱美國堅果，發(fā)生在北美密歇西比河流域。它是一種無性系魚類。它生長迅速，病蟲害少，耐低溫，肉質(zhì)細膩，易于吞咽。在20世紀(jì)70年代開始普及于世界各地。我國廣東佛山順德地區(qū)是大口黑鱸的主要養(yǎng)殖區(qū)。2008年至2010年初,順德地區(qū)大口黑鱸養(yǎng)殖魚塘大面積暴發(fā)疾病,造成重大經(jīng)濟損失。對瀕死魚剖檢發(fā)現(xiàn)魚鰾腫大,布滿紅色氣腺。魚鰾、腎臟研磨除菌后,接種鯉魚上皮瘤細胞(EpitheliomaofPapulosumcyprini,EPC)分離到致病性大口黑鱸虹彩病毒(Largemouthbassranavirus,暫命名LMBV-C株)。LMBV在大口黑鱸國內(nèi)主養(yǎng)區(qū)的暴發(fā)引起了我們對該病的關(guān)注。由于國內(nèi)對LMBV的研究報道較少,為了對LMBV進行深入的了解,并對該病的研究與防控提供參考,本文將目前國內(nèi)外已有的關(guān)于LMBV的研究報道進行綜述。1大口黑地震病毒及病毒分類大口黑鱸病毒最早分離自1991年美國佛羅里達州LakeWeir市的野生大口黑鱸。1995年美國南卡羅萊納州的Santee-Cooper水庫養(yǎng)殖的大口黑鱸暴發(fā)魚災(zāi)(fishkill)引起人們高度關(guān)注,此后兩三年內(nèi),在美國阿拉巴馬州、喬治亞州、路易斯安那州、密西西比州和德克薩斯州相繼暴發(fā)不同程度魚災(zāi),經(jīng)病原分離鑒定為大口黑鱸病毒。1996年,PlumbJA等通過實驗室分離鑒定將大口黑鱸病毒歸類到虹彩病毒科,1999年MaoJ等綜合大口黑鱸病毒蛋白合成分析,限制性片段長度多態(tài)分析(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP),主衣殼蛋白(majorcapsidprotein,MCP)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,DMet)基因序列分析的結(jié)果,明確了大口黑鱸虹彩病毒的分類地位為虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)成員。MaoJ等還比較了LM-BV、裂唇魚病毒(Doctorfishvirus,DFV)、孔雀魚病毒(Guppyfishiridovirus,GV6)、蛙病毒3(Frogvirus3,FV3)等的MCP和DMet基因的氨基酸序列,以及它們的限制性內(nèi)切酶圖譜,結(jié)果顯示DFV、GV6和LMBV之間同源性高,與蛙病毒代表株FV3有一定差距。因此,MaoJ建議LMBV、DFV和GV6組成蛙病毒屬的新種,在國際病毒分類委員會第八次報告中將LMBV、DFV、GV6歸類為蛙病毒屬的Santee-Cooperranavirus種,該種名也反映了LMBV導(dǎo)致魚災(zāi)的暴發(fā)地點。2大口黑病病毒病對美國的影響目前對于大口黑鱸病毒的研究報道仍然是以大口黑鱸原產(chǎn)地美國為主。自從1995年在美國南卡羅萊納州的Santee-Cooper水庫暴發(fā)LMBV導(dǎo)致的魚災(zāi),此后,美國東南部又暴發(fā)了幾次大口黑鱸大規(guī)模死亡病例。目前,美國已經(jīng)報道發(fā)生大口黑鱸病毒病的州包括阿拉巴馬州、阿肯色州、佛羅里達州、喬治亞州、伊利諾斯州、印第安納州、肯塔基州、路易斯安那州、密歇根州、密西西比州、密蘇里州、北卡羅萊納州、俄克拉荷馬州、南卡羅萊納州、田納西州、德克薩斯州、維吉尼亞州、佛蒙特州、威斯康星州等。GroocockGH等發(fā)表的研究結(jié)果顯示,其在紐約州37個地區(qū)收集了283尾野生大口黑鱸和8尾小口黑鱸,采用定量PCR(QPCR)的方法對來自13個地區(qū)的28尾魚檢測LMBV顯示陽性,證實美國紐約州也存在LMBV。大口黑鱸虹彩病毒在其他國家的暴發(fā)鮮有報道,鄧國成等報道了大口黑鱸潰瘍病是由虹彩病毒感染引起的,這是國內(nèi)對大口黑鱸虹彩病毒導(dǎo)致潰瘍病的首次報道。3水體傳播lmsv一般認為健康魚感染LMBV主要是通過在水體里接觸病原或者食入帶病魚餌,人工感染實驗和孵化場還未發(fā)現(xiàn)垂直傳播的病例。由于對LMBV天然宿主的范圍缺乏系統(tǒng)調(diào)查,其通過水體傳播病毒的作用仍然不能忽視。ShubhankarN等也已經(jīng)證實,熒光假單胞菌生物膜(biofilm)和池塘混合生物膜包裹的LMBV,保留對EPC細胞的感染能力,并對次氯酸鈉、碘復(fù)合物等消毒劑具有一定抵抗力。除了魚類,實驗室感染試驗證實,LMBV在兩棲類和禽類中可以存活,水陸傳播LMBV也就成為可能。國外有眾多的垂釣俱樂部,大口黑鱸是主要的競釣品種之一,因此通過垂釣者和船只傳播病毒也是重要途徑之一。4混合感染的原因LMBV不僅可以導(dǎo)致大面積魚暴發(fā)疾病死亡引起魚災(zāi),也可以是不表現(xiàn)任何癥狀的隱性帶毒,這給疾病診斷帶來困難。對該病的診斷必須綜合流行情況、癥狀、剖檢、病毒分離鑒定等進行判定。該病一般在夏季暴發(fā),30℃的水溫是病毒復(fù)制和人工感染試驗的理想溫度。因此,夏季大口黑鱸暴發(fā)不明病因、無明顯癥狀的大批死亡,首先懷疑是否LMBV感染。自然感染病毒的大口黑鱸,一般浮在水面,大多沒有肉眼可見典型癥狀,但剖檢可見魚鰾膨大,布滿紅色氣腺。有時魚鰾中有黃色或褐色蠟樣分泌物。在對該病進行臨床診斷時,即使出現(xiàn)上述癥狀,也不能僅僅懷疑是LMBV感染,必須考慮其他病原感染的可能性,因為外表健康的大口黑鱸中也可以分離到LMBV,LMBV可能并不是導(dǎo)致發(fā)病的主要原因。LMBV的分離與魚類其他病毒相比較為容易,因為該病毒可以在許多常見細胞系如鮭科、鯉科、鮰科魚類細胞上增殖,引起明顯的細胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)。但由于病毒在組織中拷貝數(shù)存在差異,有時病毒的細胞分離未必成功。2001年7月份美國阿拉巴馬州進行LMBV的流行病學(xué)調(diào)查,采用細胞培養(yǎng)方法檢測LMBV陽性率為13%,采用PCR方法檢測得到的陽性率為57%?？梢?分子生物學(xué)方法如PCR和血清學(xué)方法如ELISA,可以很好地輔助病原的鑒定。此外,采用定量PCR檢測方法可以精確計算各感染組織中病毒拷貝數(shù)。在混合感染情況下,LMBV的作用仍然未知。可能是其他病原感染導(dǎo)致機體免疫力下降,使得LMBV能夠快速增殖到被檢測水平,也可能是感染LMBV后,魚類對其他病原更易感。5感染lm-bv的致病機制LMBV不僅僅感染大口黑鱸,還感染太陽魚科的小口黑鱸,斑點黑鱸,藍鰓太陽魚,紅胸太陽魚,白刺蓋太陽魚和黑斑刺蓋太陽魚,但目前發(fā)現(xiàn)其只對大口黑鱸有致死性。ZilbergD等進行LMBV的人工感染試驗,結(jié)果顯示,以106.2TCID50/0.1mL劑量通過腹腔注射的方式攻毒,感染后第3天,病魚呈現(xiàn)螺旋狀游動,第4天病魚體色發(fā)黑、無活力、腹部輕度膨大。攻毒魚在3d~5d內(nèi)全部死亡,瀕死魚組織中檢測到病毒含量為107.8~109.2TCID50/g。瀕死魚剖檢后,觀察到肝臟表面局部蒼白,脾臟鮮紅色,腸系膜和靠近盲腸部位的脂肪有充血現(xiàn)象。組織病理學(xué)結(jié)果顯示,所有感染魚都有急性腹膜炎癥狀,這與同種屬病毒DFV和GV6引起的病變不同,后者往往導(dǎo)致造血器官壞死病變。感染LM-BV的魚肝臟、胃、腸道和脾臟表層部分出現(xiàn)壞死和炎性病變,但是深層部分表現(xiàn)正常。魚鰾與腹腔接觸表面有纖維蛋白滲出物。胃腸道的黏膜上皮層有局部壞死病灶。所有感染魚在注射部位有2mm~3mm大小的炎癥病灶,可能是注射引起的一過性損傷。BerkBH等以1.7×103pfu/mL劑量采用浸泡方式對225尾平均體重79g的大口黑鱸攻毒,所有瀕死魚浮在水面,魚鰾極度膨脹。感染魚組織器官病毒檢測顯示,攻毒4d~5d是感染高峰期,魚鰾、鰓和后腎是最容易受LMBV侵襲的器官。由于在自然環(huán)境下,大口黑鱸隱性帶毒的情況比較普遍,因此LMBV的致病性存在差異。InendinoKR等研究了環(huán)境應(yīng)激因素對LMBV發(fā)病的影響,試驗證實水體環(huán)境的劇烈變化、飼養(yǎng)密度過大都會導(dǎo)致感染LMBV的大口黑鱸病死率上升。單靠LMBV導(dǎo)致魚災(zāi)在自然條件下可能性并不高,大部分研究人員還是認為協(xié)同感染,環(huán)境劇變?nèi)缢疁赝蝗簧仙?、溶氧降?會導(dǎo)致該病的暴發(fā)。6臨床表現(xiàn)正常的帶毒魚l改由于LMBV在發(fā)病機理、流行病學(xué)方面的研究并不深入,再加上野生魚類帶毒情況的普遍性,目前對LMBV還沒有采取有效的防控措施。很多研究者也期望通過對各種外界因素與發(fā)病的研究,探討切斷LMBV感染并導(dǎo)致魚災(zāi)的可能性。GregoryMS等在美國德克薩斯州進行為期數(shù)年的跟蹤調(diào)查,發(fā)現(xiàn)LMBV的感染與外傷、鉤形標(biāo)記、外寄生蟲、性別、抓捕方式、體長、體重等因素均沒有顯著關(guān)聯(lián)。不過,盡管如此,加強日常管理對于該病的散播和流行仍然是必不可少的。對于任何新老病原,多數(shù)研究人員提出還是從導(dǎo)致病害發(fā)生的常規(guī)的三個因素宿主、病原和環(huán)境入手。目前已有研究證明,環(huán)境的惡變會導(dǎo)致LMBV的暴發(fā),如水溫的升高,溶氧降低,頻繁捕捉等。人工感染試驗也已經(jīng)證實,有些魚一旦感染上LMBV,幾天之內(nèi)就能產(chǎn)生癥狀;同樣條件下,有些魚不會產(chǎn)生任何癥狀,但是可以攜帶病毒。說明個體上的差異也是存在的。對于這些臨床表現(xiàn)正常的帶毒魚,有幾個疑問尚未解決:(1)這些臨床表現(xiàn)正常的魚是否已經(jīng)從感染中恢復(fù),只是不能將病毒從體內(nèi)清除;(2)這些帶毒魚以后是否會發(fā)病;(3)這些帶毒魚是否已經(jīng)產(chǎn)生抵抗力;(4)這些帶毒魚其實已經(jīng)發(fā)病,只是癥狀不明顯。怎樣控制這些無癥狀帶毒魚到處傳播病毒是目前防控的難題。從2000年開始,美國私人組織———鱸魚垂釣愛好者協(xié)會(BassAnglersSportsmanSociety,簡稱BASS)每年發(fā)起并主辦關(guān)于LM-BV的研討會,邀請來自各州、聯(lián)邦機構(gòu)、高校的管理者、專家和研究人員共同探討LMBV的解決辦法,這一做法一直持續(xù)到現(xiàn)在,對于跟蹤LMBV的散播、確定發(fā)病相關(guān)因素起到了非常積極的作用。7大口黑地震病病毒防控的展望從20世紀(jì)90年代開始,中國池塘養(yǎng)殖大口黑鱸發(fā)生的病害越來越復(fù)雜,爛鰓病、腸炎病、腐皮病、水霉病、車輪蟲病、杯體蟲病等暴發(fā)時有報道。導(dǎo)致大口黑鱸發(fā)病的病原主要是嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌、霉菌和寄生蟲,確診由病毒感染導(dǎo)致發(fā)病的報道較少,2009年鄧國成等人報道的大口黑鱸潰瘍病是由虹彩病毒感染引起的,這也是國內(nèi)對LM-BV的首次報道。經(jīng)過20多年的馴化飼養(yǎng),大口黑鱸的養(yǎng)殖量在國內(nèi)頗具規(guī)模,但LMBV在國內(nèi)還未引起足夠的重視,歸因于其感染性雖然廣泛,但是引起大規(guī)模致死性暴發(fā)的病例報道并不多,再加上魚病癥狀復(fù)雜,許多未進行病毒分離鑒定的病例也將其簡單歸結(jié)于細菌感染。目前,虹彩病毒病的防控方面沒有特效藥物。在虹彩病毒科的5個病毒屬中,由于腫大細胞病毒感染商業(yè)價值較高的淡水和海水魚類,其致病機理和疫苗研發(fā)也一直是近幾年研究的重點。如日本已經(jīng)研發(fā)并商品化真鯛虹彩病毒(Redseabreamiridovirus,RSIV)注射型全細胞滅活疫苗,并且針對RSIV研發(fā)的DNA疫苗也顯示出良好的保護效果。但是對于大部分已經(jīng)報道的腫大細胞虹彩病毒來說,因為難以實現(xiàn)在常見魚類細胞中增殖,細胞苗的開發(fā)有一定難度。蛙病毒在感染細胞方面具有得天獨厚的優(yōu)勢,不僅可以感染許多魚類細胞系,在一些常見哺乳動物細胞系如幼倉鼠腎細胞(BHK)、人宮頸癌上皮細胞(Hela)、人腎上皮細胞系(293T)上也能進行正常增殖