附件5那西肽殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)(試行)雞可食性組織中那西肽殘留量的測(cè)定高效液相色譜法(試行)1范圍本方法規(guī)定了雞可食性組織中那西肽的制樣和高效液相色譜測(cè)定方法。本方法適用于雞的肌肉、肝臟、腎臟和皮+脂肪中那西肽殘留量的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注口期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3原理試樣中殘留的那西肽用乙月青提取，正己烷脫脂，高效液相色譜-熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。4試劑除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合GB“6682規(guī)定的一級(jí)水。試劑和材料乙情(CHjCN)：色譜純。甲醇(CH3OH)：色譜純。N,N—二甲基甲酰胺(HCON(CH3)2):色譜純。磷酸(H3Po4)。正己烷(C6H14)o溶液配制磷酸溶液：量取磷酸0.25mL加水至1000mL,搖勻，即得。標(biāo)準(zhǔn)品那西肽(Nosiheptide,C51H43N13O12S6,CAS號(hào):56377-79-8)：含量*8.0%,或相當(dāng)者。標(biāo)準(zhǔn)溶液制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取那西肽標(biāo)準(zhǔn)品約25mg,于25mL量瓶中，用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。-20℃保存，有效期6個(gè)月。標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確量取1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1mL,于100mL量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，配置成濃度為1pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20C保存，有效期3個(gè)月.材料有機(jī)微孔濾膜：0.225儀器和設(shè)備高效液相色譜儀：配有熒光檢測(cè)器(FLD)。分析天平：感量0.00001g和0.01g。氮吹儀。旋渦混合器：3000轉(zhuǎn)/分鐘。勻漿機(jī)。離心機(jī)：3000轉(zhuǎn)/分鐘。振蕩器。的制備與保存試料的制備取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，絞碎，并使均質(zhì)?！【|(zhì)后的供試樣品，作為供試試料?！【|(zhì)后的空白樣品，作為空白試料?！【|(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為空白添加試料。試料的保存-20℃以下保存。7測(cè)定步驟提取稱(chēng)?。?±0.05）g試料于50mL離心管中，加入10mL乙臘，并加入陶瓷均質(zhì)子，渦旋混勻，振蕩提取10分鐘；于5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，傾出上清液至另一個(gè)50mL離心管中，剩余殘?jiān)?0mL乙牌重復(fù)提取一次，合并兩次提取上清液，加入20mL正己烷，渦旋1分鐘，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去上層正己烷層，取下層液體40C下氮吹至干；準(zhǔn)確加入1.0mL甲醇渦旋混勻1分鐘，過(guò)濾膜后供高效液相色譜儀測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別精密錄取標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇稀釋成濃度為0.01、0.02、0.04、（）.1、0.2pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜儀測(cè)定。臨用前配制。以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。液相色譜參考條件a）色譜柱:C18柱（250mmx4.6mm,5pm）,或相當(dāng)者;b）柱溫：30°C；c）進(jìn)樣量：20pL；d）流速：l.OmL/min：e）熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)327nm,發(fā)射波長(zhǎng)521nm；f）流動(dòng)相：磷酸溶液和乙盾，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。表1流動(dòng)相梯度洗脫條件時(shí)間磷酸溶液乙胞(min)(%)(%)05248852488.1010012010012性測(cè)定試樣溶液色譜圖的保留時(shí)間在標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間偏差的±2.5%之內(nèi)。定量測(cè)定取試樣溶液和相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣溶液中那西肽響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。在卜.述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試樣溶液和空白添加試樣溶液色譜圖見(jiàn)附錄A中圖A1?圖A3?？瞻自囼?yàn)取空白試料，除不加標(biāo)準(zhǔn)溶液外，采用完全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。8結(jié)果計(jì)算與表述單點(diǎn)校準(zhǔn)，試料中那西肽殘留量按下式計(jì)算：CsXAXVX=-AsXm或標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)：由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程4二aC+b,求得a和b,則「A-bc=a按下式計(jì)算那西肽的殘留量：CXVx=m式中：X一試樣中相應(yīng)的那西肽殘留量，單位為微克每千克（Rg/kg）；Cs——標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的那西肽濃度，單位為微克每升（腐/L）；C—試樣溶液中那西肽濃度，單位為微克每升Rg/L）；A——試樣溶液中相應(yīng)的那西肽的色譜峰面積；A.,一標(biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的那西肽色譜峰面積：V—溶解殘余物所用的溶液體積，單位為亳升（mL）；ni 試樣質(zhì)量，單位為克（g）o注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。測(cè)定結(jié)果用兩次平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。9方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度靈敏度本方法的檢測(cè)限為5|ig/kg,本方法的定量限為1Opg/kgo準(zhǔn)確度本方法在1（誕/kg?60pg/kg添加濃度水平上的回收率為60%?120%。精密度本方法批