CREB激活促進(jìn)神經(jīng)痛大鼠脊髓背角HCN4轉(zhuǎn)錄的實(shí)驗(yàn)研究

王蓉，萬(wàn)琪，謝曄，徐陶，曾俊偉，劉曉紅(遵義醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，貴州遵義563099)脊髓背角可以接受來(lái)自外周的傷害性信息并將其傳至大腦高級(jí)中樞，而腦內(nèi)的下行抑制/易化系統(tǒng)也可對(duì)傷害性信息進(jìn)行調(diào)制[1]。近年研究表明，超極化激活的環(huán)核苷酸門控(Hyperpolarization-activatedcyclicnucleotide-gating，HCN)通道有4個(gè)成員，分別為HCN1-4，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生與維持中發(fā)揮重要作用[1-2]。在脊髓背角，HCN4表達(dá)于GABA能抑制性中間神經(jīng)元和蛋白激酶Cγ(ProteinkinaseCγ，PKCγ)陽(yáng)性興奮性中間神經(jīng)元[3-7]。鞘內(nèi)給予HCN通道阻滯劑ZD7288明顯減輕慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷(Chronicconstrictioninjury，CCI)或糖尿病大鼠的熱痛及機(jī)械痛癥狀，并顯著抑制其脊髓背角HCN4表達(dá)上升[3-6]。而且，鞘內(nèi)注射HCN4慢病毒顆粒導(dǎo)致背角HCN4表達(dá)下調(diào)，明顯緩解化療大鼠的機(jī)械痛敏，其機(jī)制與抑制背角γ-氨基丁酸B型受體(Gamma-aminobutyricacidreceptor，GABABR)表達(dá)有關(guān)[8]。因此，探討HCN4通道的表達(dá)調(diào)控機(jī)制有助于以HCN4通道作為靶點(diǎn)進(jìn)行鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)。環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A(Cyclicadenosinemonophosphate-proteinkinaseA，cAMP-PKA)信號(hào)通路在HCN4通道的活性調(diào)節(jié)中具有重要作用。環(huán)磷酸腺苷(Cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)與HCN4通道蛋白的cAMP結(jié)合域結(jié)合，隨后HCN4通道開放,形成的凈內(nèi)向電流使細(xì)胞興奮性增強(qiáng)[9]。PKA抑制劑可抑制大鼠背根節(jié)以及前額葉皮層神經(jīng)元HCN通道電流，導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性降低[10-11]。在坐骨神經(jīng)損傷大鼠中，脊髓背角cAMP-PKA信號(hào)通路的激活促進(jìn)鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calmodulin-dependentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ)活化和轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Cyclic-AMPresponsebindingprotein，CREB)磷酸化，引起下游疼痛相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[12-14]。然而，目前并不清楚信號(hào)分子PKA、CaMKII和CREB的激活是否促進(jìn)神經(jīng)痛大鼠脊髓背角HCN4轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。CREB作為轉(zhuǎn)錄因子，是否能夠結(jié)合到HCN4啟動(dòng)子序列并促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)制備CCI神經(jīng)痛模型，鞘內(nèi)分別給予H-89(PKA抑制劑)，KN-93(CaMKⅡ抑制劑)或NaphtholAS-E(CREB抑制劑)，觀察這些工具藥對(duì)神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械痛行為的影響，分析PKA、CaMKII和CREB的激活對(duì)脊髓背角HCN4轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響。1材料與方法1.1試劑H-89(PKA抑制劑，B1427)、KN-93(CaMKⅡ抑制劑，K1385)來(lái)自美國(guó)Sigma；NaphtholAS-E(CREB抑制劑，HY-104068)來(lái)自MCE；兔抗HCN4多克隆抗體(55224-1-AP)、兔抗CREB多克隆抗體(12208-1-AP)、兔抗β-actin多克隆抗體(20536-1-AP)、小鼠抗β-actin單克隆抗體(66009-1-Ig)均來(lái)自美國(guó)Proteintech；兔抗p-CaMKⅡ(Ser286)單克隆抗體(12716S)、兔抗p-CREB(Ser133)單克隆抗體(9198S)來(lái)自美國(guó)CellSignalingTechnology；兔抗GAPDH單克隆抗體(ET1601-4)來(lái)自華安生物；小鼠抗PKA單克隆抗體(sc-365615)、小鼠抗CaMKⅡ單克隆抗體(sc-5306)來(lái)自SantaCruz；兔抗p-PKA單克隆抗體(ab75991)來(lái)自Abcam；CREB探針及引物來(lái)自上海生工有限公司；核蛋白提取試劑盒(NT-032)來(lái)自Invent公司；Triozl試劑(9108)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A)和SYBRGreen熒光染料試劑盒(RR820A)來(lái)自TaKaRa；EMSA試劑盒(GS009)來(lái)自上海碧云天生物科技公司。1.2主要儀器電子VonFrey測(cè)痛儀購(gòu)自美國(guó)IITCLifeScience；電泳儀和電泳槽和半干電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-RadLaboratories；全能型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)Syngene；QuantStudioTM6FlexPCR儀購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherscientific。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組體重200～230g雄性SD大鼠購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤公司[許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0014]；實(shí)驗(yàn)期間大鼠分籠，于溫度(22±2)℃、濕度50%左右、晝夜交替12h環(huán)境中飼養(yǎng)。分為6組：(1)Sham組；(2)Sham+Vehicle組；(3)CCI+Vehicle組；(4)CCI+H-89(8nM)；(5)CCI+KN-93(50nM)；(6)CCI+NaphtholAS-E(5μg/10uL)。Sham組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不結(jié)扎。其余各組大鼠在鞘內(nèi)置管7d后建立CCI模型,術(shù)后分別鞘內(nèi)注射0.005%DMSO生理鹽水、H-89、KN-93或NaphtholAS-E。10μL/次，連續(xù)7d，每天1次。1.4建模1.4.1鞘內(nèi)置管戊巴比妥鈉(40mg/kg，i.p.)麻醉大鼠，取俯臥位固定，在L3～L4間隙縱向切開背部皮膚，分離L4棘突兩側(cè)肌肉，剪掉L4棘突及相鄰的白色椎板，使L3與L4棘突間隙得以暴露出來(lái)，用彎針挑破黃韌帶及硬腦膜，當(dāng)看到腦脊液溢出時(shí)，在此處插入PE-10導(dǎo)管，然后輕輕向上推2cm，到達(dá)腰膨大處，隨后將導(dǎo)管尖端固定在大鼠頸部區(qū)域。術(shù)后注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后第2天通過(guò)導(dǎo)管注射2%利多卡因(15μL)，若注射后30s內(nèi)出現(xiàn)雙側(cè)下肢癱軟，則為置管成功。只有無(wú)明顯神經(jīng)癥狀的正常大鼠被納入實(shí)驗(yàn)。1.4.2CCI模型大鼠置管成功7d后，戊巴比妥鈉(40mg/kg，i.p.)麻醉并固定，在股骨外側(cè)上方縱向切開長(zhǎng)約1.5cm的切口，鈍性分離肌肉，使坐骨神經(jīng)完全暴露，用4.0非吸收性醫(yī)用縫合線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間距大約為1mm。結(jié)扎強(qiáng)度一般以引起小腿肌肉輕微顫動(dòng)為宜。術(shù)后分籠飼養(yǎng)并注意清潔以防感染。Sham組大鼠僅暴露坐骨神經(jīng)不結(jié)扎。1.5行為學(xué)測(cè)定利用電子足底觸覺測(cè)定儀來(lái)檢測(cè)大鼠的MWT。在相對(duì)安靜的環(huán)境中，將上述各組大鼠分別單獨(dú)放置于金屬絲網(wǎng)眼的透明玻璃籠中，待大鼠適應(yīng)環(huán)境15～20min后，將剛性尖端垂直地刺向大鼠后爪足底皮膚，在此過(guò)程中，若大鼠出現(xiàn)輕微的肌肉收縮或后爪抬起的反應(yīng)，則判斷為陽(yáng)性反應(yīng)，此時(shí)可記錄下儀器上顯示的縮爪閾值，切斷值設(shè)置為60g。每5分鐘檢測(cè)1次，重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。所有大鼠均在CCI手術(shù)前1d，術(shù)后1、3、5、7d測(cè)定。1.6WB檢測(cè)脊髓背角HCN4、PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表達(dá)CCI術(shù)后7d，戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，取術(shù)側(cè)的背側(cè)脊髓約7mm(L4～L6)，置于EP管中，加入200μLRIPA裂解混合液(RIPA：蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)后，用高通量組織研磨儀研磨混合后置于冰上，裂解30min，每隔10min震蕩一次；4℃，12000rpm離心20min，取上清液，用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，其余上清液加入上緩變性。每孔加80μg蛋白，SDS電泳，膜轉(zhuǎn)移，5%脫脂奶粉封閉2h。加入兔源HCN4抗體(1∶500)，小鼠源PKA抗體(1∶100)，兔源p-PKA抗體(1∶1000)，小鼠源CaMKⅡ抗體(1∶100)，兔源p-CaMKⅡ抗體(1∶1000)，兔源CREB抗體(1∶500)，兔源p-CREB抗體(1∶1000)，兔源GAPDH抗體(1∶50000)，兔源β-actin抗體(1∶3000)，小鼠源β-actin抗體(1∶5000)，4℃過(guò)夜后。將膜放在TBST中清洗3次，每次間隔10min，隨后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3000)或羊抗小鼠二抗(1∶5000)，室溫孵育1h，再次洗膜30min，清洗完畢的PVDF膜采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，將顯影液混勻后滴在膜上，并放入儀器內(nèi)曝光顯色。數(shù)據(jù)采取ImageJ1.48軟件處理，GAPDH或β-actin為內(nèi)參，以相對(duì)蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[(實(shí)驗(yàn)組目的蛋白灰度值/實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參灰度值)/(Sham組目的蛋白灰度值/Sham組內(nèi)參灰度值)]。1.7RT-qPCR檢測(cè)HCN4mRNA表達(dá)CCI術(shù)后7d，用戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，取術(shù)側(cè)的背側(cè)脊髓約7mm(L4～L6)，置于無(wú)酶的EP管中，Trizol法抽提組織總mRNA。純化后，使用無(wú)酶水洗脫RNA，并測(cè)定其濃度和純度。260∶280的吸光度比應(yīng)在1.9～2.1的范圍內(nèi)。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光染料試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)GenBank上搜索的序列設(shè)計(jì)引物。本研究中使用的引物的核苷酸序列如下：(1)HCN4(genebank:NM_021658.2):F:5′-CACTAAGGGCAACAAGGAGACCAAG-3′；R:5′-TGAGTAGAGGCGGCAGTAAGTATCC-3′，(2)β-actin(genebank:NM_007393.5):F:5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′；R:5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。qPCR的體系為20μL，其中7μLDEPC水、10μLTBGreen?PremixExTaqTMⅡ、0.5μLPCRForwardPrimer(10μM)、0.5μLPCRReversePrimer(10μM)和2μLcDNA。每個(gè)孔均要做復(fù)孔。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：37℃，15min，85℃，5s；擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，統(tǒng)計(jì)各組CT值，采用2-△△CT(Livak法)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。1.8電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)CREB與HCN4啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合活性CCI術(shù)后7d，用戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，取術(shù)側(cè)的背側(cè)脊髓約7mm(L4～L6)，置于EP管中，根據(jù)胞核提取試劑盒說(shuō)明書步驟提取核蛋白，BCA法測(cè)定核蛋白濃度，-80℃保存。在PROMO和JASPAR數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子CREB可能與HCN4啟動(dòng)子區(qū)域的四段序列結(jié)合。因此，由上海生工有限公司合成生物素3′端DNA標(biāo)記的CREB探針，分別為CREB-1(234-255bp):5′-GCTCCAGGTGATGTCATCACCC-3′；CREB-2(838-859bp):5′-CAGAGTATCAGGTCACCAGAGG-3′；CREB-3(1409-1430bp):5′-GGAGTAAGGACGCCTCCTACCT-3′；CREB-4(1668-1689bp):5′-CGGCGGCTGATGTAAGCCCGGC-3′，將探針退火為雙鏈。使用EMSA化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)CREB與HCN4啟動(dòng)子之間的結(jié)合活性。核蛋白-DNA探針反應(yīng)總體積為10μL：核蛋白5μg，2μL5×Bindingbuffer，室溫反應(yīng)10min后，加入生物素標(biāo)記探針1μL，反應(yīng)20min，剩余用無(wú)酶水補(bǔ)足10μL；隨后加入1μL10×Loadingbuffer。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)：體系中添加100倍量的未標(biāo)記的CREB探針，室溫孵育20min后加入標(biāo)記探針，其余步驟一致。然后將反應(yīng)物在5%凝膠上進(jìn)行電泳，隨后轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上，其余步驟參照EMSA試劑盒說(shuō)明書。2結(jié)果2.1鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或NaphtholAS-E抑制劑對(duì)CCI大鼠機(jī)械痛閾的影響在坐骨神經(jīng)結(jié)扎前1d，結(jié)扎后1、3、5、7d內(nèi)，檢測(cè)各組大鼠機(jī)械痛閾變化。結(jié)果顯示(見圖1)，Sham組和Sham+Vehicle組的MWT始終穩(wěn)定于基礎(chǔ)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Sham組相比，CCI+Vehicle組在第1、3、5、7天的MWT明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.2鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或NaphtholAS-E對(duì)CCI大鼠脊髓背角HCN4表達(dá)的影響如圖2A，Sham組和Sham+Vehicle組背角HCN4mRNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Sham組相比，CCI+Vehicle組脊髓背角HCN4mRNA表達(dá)顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明HCN4表達(dá)受PKA、CaMKII和CREB調(diào)控。*:與Sham組比較,P<0.05；+:與CCI+Vehicle組比較,P2.3鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或NaphtholAS-E對(duì)CCI大鼠脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ、CREB和p-CREB表達(dá)的影響如圖3，Sham組和Sham+Vehicle組脊髓背角PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Sham組相比，CCI+Vehicle組PKA、p-PKA、CaMKII、p-CAMKⅡ、CREB和p-CREB表達(dá)顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.4鞘內(nèi)注射H-89、KN-93或NaphtholAS-E對(duì)CREB與HCN4啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合活性的影響如圖4，探針CREB-1(含有CREB激活位點(diǎn)元件的生物素3’端DNA標(biāo)記探針)與來(lái)自CCI+Vehicle組的大鼠背角核蛋白提取物混合，進(jìn)行凝膠電泳。與Sham組相比，來(lái)自CCI+Vehicle組的核提取物有效地結(jié)合大量CREB-1探針，顯示濃重的遷移條帶，然而，H-89、KN-93或NaphtholAS-E藥物治療組CREB遷移條帶減少。CCI+Vehicle組的核提取物添加過(guò)量的未標(biāo)記探針后無(wú)法檢測(cè)到CREB結(jié)合條帶。同時(shí)，盡管反復(fù)變換試驗(yàn)條件，但均未觀察到其他探針(CREB-2、CREB-3、CREB-4)與來(lái)自CCI組的核提取物形成的凝膠條帶，這初步證實(shí)CREB可以識(shí)別并結(jié)合到HCN4啟動(dòng)子區(qū)域242-249bp的序列(5′-GCTCAGGTGAGTGCCCC-3′)，參與HCN4基因轉(zhuǎn)錄。*:與Sham組比較,P<0.05；+:與CCI+Vehicle組比較,P*:與Sham組比較,P<0.05；+:與CCI+Vehicle組比較,PCREB：探針與DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合條帶；NS：non-specificband，非特異條帶；NP：noprotein，未加入蛋白提取物；UP:unlabeledprobe，無(wú)標(biāo)記探針。圖4CREB與HCN4啟動(dòng)子區(qū)域DNA結(jié)合活性3討論在脊髓背角，HCN4通道表達(dá)于抑制性中間神經(jīng)元和PKCγ+興奮性中間神經(jīng)元，參與神經(jīng)痛的形成與維持。在本試驗(yàn)中，鞘內(nèi)注射PKA抑制劑H-89、CaMKⅡ抑制劑KN-93或CREB抑制劑NaphtholAS-E均可以減輕大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)扎導(dǎo)致的機(jī)械痛敏，同時(shí)抑制脊髓背角HCN4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，提示HCN4的表達(dá)受PKA、CaMKⅡ及轉(zhuǎn)錄因子CREB的調(diào)控。cAMP是一種細(xì)胞內(nèi)的第二信使物質(zhì)，胞內(nèi)cAMP濃度升高和隨后的PKA激活均有助于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元HCN通道開放并形成凈內(nèi)向電流，感覺神經(jīng)元興奮性增加，引起痛覺敏化[15]。目前已發(fā)現(xiàn)的4種HCN通道(HCN1-4)中，對(duì)cAMP的反應(yīng)敏感性依次為：HCN4>HCN2>HCN3>HCN1[4,16]。本試驗(yàn)中，鞘內(nèi)注射PKA抑制劑H-89導(dǎo)致CCI大鼠脊髓背角PKA表達(dá)下降，磷酸化減弱，同時(shí)也下調(diào)HCN4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)?？梢?，PKA激活不僅有助于HCN4通道開放，也有助于其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在神經(jīng)痛的發(fā)生和維持過(guò)程中，背角cAMP/PKA通路的激活促進(jìn)CaMKII活化和其下游轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化，特別是CREB的Ser-133位點(diǎn)磷酸化直接受PKA和CaMKII的調(diào)控[12-13,17]。本試驗(yàn)分別鞘內(nèi)注射KN-93或NaphtholAS-E，隨后CCI大鼠脊髓背角CaMKII和CREB的表達(dá)及磷酸化程度均減弱，HCN4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)明顯下降。更重要的是，鞘內(nèi)注射PKA抑制劑H-89導(dǎo)致CCI大鼠背角CaMKII和CREB的表達(dá)及磷酸化程度均減弱，這說(shuō)明PKA的激活有助于CaMKII和CREB的表達(dá)及磷酸化，而CaMKII和CREB的激活對(duì)于HCN4的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)也非常重要。CREB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，其C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)既可以與靶基因的經(jīng)典cAMP反應(yīng)元件(cAMPresponseelement，CRE，含5'-TGACGTCA-3′回文序列)結(jié)合，或與CRE變體序列5′-TGATGTCA-3′結(jié)合，也可以與非經(jīng)典CRE序列(如5′-AGGCGTGG-3′或5′-AGGATGCG-3′等)結(jié)合并啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄[18]。Smith等[19]針對(duì)哺乳動(dòng)物(如人、大鼠、小鼠以及狗)的基因組序列進(jìn)行研究，觀察到5′-TGATGTCA-3′是最常見的CRE變體序列。本試驗(yàn)檢測(cè)到CREB可以識(shí)別并結(jié)合到HCN4啟動(dòng)子區(qū)域242-249bp序列(5′-TGATGTCA-3′，為哺乳動(dòng)物體內(nèi)最常見的CRE變體序列)，促進(jìn)HCN4基因轉(zhuǎn)錄。在HCN4啟動(dòng)子序列中并沒有檢測(cè)到經(jīng)典cAMP反應(yīng)元件的存在。因此，初步推測(cè)，在CCI大鼠脊髓背角HCN4的轉(zhuǎn)錄增加，是由于轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化之后，進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合到HCN4啟