熒光分析法現(xiàn)代表征方法與技術(shù)------FluorescenceAnalysis

1熒光分析法現(xiàn)代表征方法與技術(shù)------Fluorescen《熒光分析法》第三版

許金鉤、王尊本主編，科學(xué)出版社參考書《PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy》(II、III),

J.R.Laowisz,

KluwerAcademic/PlenumPublisher

2《熒光分析法》第三版參考書《PrinciplesofFl一、分子熒光的產(chǎn)生過(guò)程二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、影響熒光強(qiáng)度的因素第一節(jié)分子熒光原理

Principle

ofFluorescence3一、分子熒光的產(chǎn)生過(guò)程第一節(jié)分子熒光原理Pri一、儀器與結(jié)構(gòu)流程二、激發(fā)光譜與熒光光譜

三、熒光分析法和應(yīng)用

第二節(jié)分子熒光分析法FluorescenceAnalysis

4一、儀器與結(jié)構(gòu)流程

第二節(jié)分子熒光分析法Fluoresc一、熒光的產(chǎn)生過(guò)程

LuminescenceProcessofMolecularFluorescence*分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜，分子所具有的能級(jí)數(shù)目遠(yuǎn)多于原子能級(jí)數(shù)目。在每個(gè)分子的電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)；*基態(tài)→激發(fā)態(tài)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；*激發(fā)態(tài)→基態(tài)：弛豫過(guò)程，多種途徑和方式；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)；1.分子能級(jí)與躍遷5一、熒光的產(chǎn)生過(guò)程

LuminescenceProce2.電子激發(fā)態(tài)的多重度*大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；*電子激發(fā)態(tài)有單重態(tài)與三重態(tài)之分（取決于電子的自旋方向

M=2S+1，S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；*根據(jù)洪特規(guī)則，平行自旋（三重態(tài)）比成對(duì)自旋（單重態(tài)）穩(wěn)定，因此，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低；

S0→T1

屬于禁阻躍遷，需要通過(guò)其他途徑進(jìn)入，而且進(jìn)入的幾率??；

62.電子激發(fā)態(tài)的多重度*大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)；3.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量。傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間竄越振動(dòng)弛豫無(wú)輻射躍遷73.激發(fā)態(tài)→基態(tài)的能量傳遞途徑電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫8S2S1S0T1吸發(fā)發(fā)系間竄躍內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能l2l1l非輻射能量傳遞過(guò)程

振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10-12s。

內(nèi)轉(zhuǎn)換：同多重態(tài)電子能級(jí)中,不同能級(jí)間的無(wú)輻射能級(jí)交換

通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；

外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。系間竄躍：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。9非輻射能量傳遞過(guò)程振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式輻射能量傳遞過(guò)程

S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系間竄躍→振動(dòng)弛豫→T1

S0磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（T1

→S0躍遷）；電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：發(fā)光速度很慢：10-4～10s，即光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間。熒光發(fā)射：第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（S1→S0躍遷）

10-7～10-9s（S0

→T1禁阻躍遷）10輻射能量傳遞過(guò)程S0→激發(fā)→振動(dòng)弛豫→內(nèi)轉(zhuǎn)移→系速率競(jìng)爭(zhēng)決定光活化電子能量遷移的途徑！熒光的光物理本質(zhì)11速率競(jìng)爭(zhēng)決定光活化電子能量遷移的途徑！熒光的光物理本質(zhì)11二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

RelationBetweenFluorescenceandMolecularStructure1.熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過(guò)程的速率常數(shù)有關(guān)，如外轉(zhuǎn)換過(guò)程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；

kF主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)，而Ski則主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也與結(jié)構(gòu)有關(guān)。大多數(shù)熒光物質(zhì)的量子產(chǎn)率在0.1~1之間。12二、熒光的產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

RelationBetw2.有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光效率高。這是因?yàn)椤?躍遷的摩爾吸收系數(shù)比n→*大，且→*躍遷的壽命比n→*要短。（2）共軛效應(yīng)：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。（3）剛性平面結(jié)構(gòu)：可降低分子振動(dòng)，減少與溶劑的相互作用，故具有很強(qiáng)的熒光。如熒光素和酚酞有相似結(jié)構(gòu)，熒光素有很強(qiáng)的熒光，酚酞卻沒(méi)有。（4）取代基效應(yīng)：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強(qiáng)。重原子效應(yīng)。132.有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)與熒光（1）躍遷類型：*→的熒光1414強(qiáng)熒光物質(zhì)往往具備以下特征：具有大的共軛p鍵結(jié)構(gòu)；具有剛性平面結(jié)構(gòu)；具有最低的單線電子激發(fā)態(tài)S1為pp*型取代基團(tuán)為給電子取代基小結(jié)：15強(qiáng)熒光物質(zhì)往往具備以下特征：具有大的共軛p鍵結(jié)構(gòu)；小結(jié)：

1.熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系

熒光強(qiáng)度

If正比于體系吸收的激發(fā)光的光強(qiáng)，即：

If=K’(I0-I)由朗-比耳定律：I/I0=10-

bc代入，得：

If=K’I0(1-10-

bc)將此式展開(kāi)，即三、影響熒光強(qiáng)度的因素

低濃度時(shí)，熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系，高濃度時(shí)，由于自吸收和自熄滅等原因，線性關(guān)系不成立。濃度很低時(shí)，ebc<0.05，則可近似寫成：

If

=2.3

I0

lc=Kc定量分析的基礎(chǔ)161.熒光強(qiáng)度和溶液濃度的關(guān)系三、影響熒光強(qiáng)度的因素

2.溶劑的影響溶劑的介電常數(shù)越大，熒光峰的波長(zhǎng)越長(zhǎng)，熒光效率越大；含有重原子的溶劑（碘乙烷）中，由于重原子效應(yīng)，使熒光減弱；溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化。3.溫度的影響熒光強(qiáng)度對(duì)溫度變化敏感，溫度增加，外轉(zhuǎn)換去活的幾率增加,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的下降。

影響熒光強(qiáng)度的外部因素172.溶劑的影響影響熒光強(qiáng)度的外部因素174.溶液pH對(duì)酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴(yán)格控制；有熒光無(wú)熒光無(wú)熒光有熒光pH<2無(wú)熒光7~12藍(lán)色熒光

>13無(wú)熒光184.溶液pH有熒光無(wú)熒光無(wú)熒光有熒光pH<2無(wú)熒光

自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收。碰撞猝滅是熒光熄滅的主要原因。5.熒光的熄滅氧的熄滅作用等。濃度越大、溫度越高，碰撞機(jī)會(huì)越大粘度越大，碰撞機(jī)會(huì)越小19自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與一、儀器結(jié)構(gòu)流程

測(cè)量熒光的儀器主要由五個(gè)部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測(cè)器、記錄裝置。

特點(diǎn)：（與UV-vis儀器的比較）有兩個(gè)單色器，光源與檢測(cè)器通常成直角。兩個(gè)單色器分別是：1）選擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器2）選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長(zhǎng)的第二單色器20一、儀器結(jié)構(gòu)流程測(cè)量熒光的儀器主要由五個(gè)部分組成：激2121檢測(cè)器：光電倍增管。樣品池：材料：與UV-vis吸收池相同。形狀：？光源：氙燈和高壓汞燈，染料激光器(可見(jiàn)與紫外區(qū))氙燈：連續(xù)光源，發(fā)射光束強(qiáng)度大。波長(zhǎng)范圍：200~700nm,在200~400nm波段內(nèi)，光譜強(qiáng)度幾乎相等。22檢測(cè)器：光電倍增管。樣品池：材料：與UV-vis吸收池形狀：儀

器

光

路

圖23儀

器

光

路

圖23二、激發(fā)光譜與熒光光譜

ExcitationSpectrumandFluorescenceSpectrumIf–λex

(固定λem)光源第一單色器第二單色器激發(fā)熒光樣品池檢測(cè)系統(tǒng)1.熒光的激發(fā)光譜曲線2.熒光的發(fā)射光譜曲線（熒光光譜）If–λem(固定λex)24二、激發(fā)光譜與熒光光譜

ExcitationSpectr粗步設(shè)定λex，掃描λem萘的激發(fā)、熒光光譜λexλem相對(duì)強(qiáng)度固定λem（最佳），掃描λex固定λex（最佳），掃描

λem熒光（發(fā)射）光譜曲線II熒光激發(fā)光譜曲線II熒光（發(fā)射）光譜曲線IIIIIIII25粗步設(shè)定λex，掃描λem萘的激發(fā)、熒光光譜λexλem相3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系

(1)Stokes位移激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。

(2)發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。263.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系(1)Stokes位移24.測(cè)定波長(zhǎng)的選擇瑞利散色和拉曼散色274.測(cè)定波長(zhǎng)的選擇瑞利散色和拉曼散色27三、熒光分析方法與應(yīng)用1.特點(diǎn)（1）結(jié)構(gòu)信息量多：包括物質(zhì)激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、光強(qiáng)、熒光量子效率、熒光壽命等。（2）選擇性強(qiáng)既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征激發(fā)光譜；（3）試樣量少，應(yīng)用范圍廣。（4）靈敏度高分析物濃度范圍：10-5～

10-8mol/L，檢測(cè)下限：0.1～0.1

g/cm-3比紫外-可見(jiàn)分光光度法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)。

28三、熒光分析方法與應(yīng)用1.特點(diǎn)28定性方法任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。定量方法

If

=2.3

I0bc

=Kc2.定性、定量方法29定性方法任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。3.熒光分析法的應(yīng)用(1)無(wú)機(jī)、有機(jī)化合物的分析在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光的無(wú)機(jī)物極少，難以利用其自身的熒光來(lái)進(jìn)行測(cè)定。通常采用與有機(jī)試劑形成配合物后測(cè)量，或通過(guò)其對(duì)熒光試劑的熒光增強(qiáng)或猝滅效應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。目前可測(cè)量元素已有約60多種。無(wú)機(jī)化合物（熒光）試劑熒光增強(qiáng)法熒光猝滅法303.熒光分析法的應(yīng)用(1)無(wú)機(jī)、有機(jī)化合物的分析無(wú)機(jī)化合物（3131但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都會(huì)生成熒光強(qiáng)度比維生素B2強(qiáng)得多的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質(zhì)可提高測(cè)定的靈敏度和選擇性。尿液中維生素B2的測(cè)定維生素B2（核黃素）在430-440nm藍(lán)光照射下會(huì)發(fā)出綠色熒光，λem為535nm。它在pH6-7的溶液中熒光強(qiáng)度最大，而在pH11時(shí)熒光消失；32但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMn熒光法測(cè)定抗壞血酸33熒光法測(cè)定抗壞血酸333434(2)生物、醫(yī)學(xué)研究?jī)?nèi)源熒光與外源探針35(2)生物、醫(yī)學(xué)研究?jī)?nèi)源熒光與外源探針35蛋白熒光36蛋白熒光36膜探針37膜探針37核酸探針38核酸探針38分子燈標(biāo)

（molecularbeacons）39分子燈標(biāo)（molecularbeacons）39分子傳感器

（molecularchemosenors）40分子傳感器（molecularchemosenors）4熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）系統(tǒng)41熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）系統(tǒng)41GFP是一種在395nm的激發(fā)光下可以釋放出綠色熒光的蛋白，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于生物以及醫(yī)學(xué)研究。該蛋白可以表達(dá)在真核細(xì)胞中，在和其他基因融合表達(dá)的情況下，可以活體示蹤目的蛋白的定位以及活動(dòng).42GFP是一種在395nm的激發(fā)光下可以釋放出綠色熒光的蛋白，通過(guò)跟蹤發(fā)出的綠光來(lái)觀察病毒在宿主體內(nèi)的擴(kuò)散途徑；或者把GFP接合到一種蛋白質(zhì)上并通過(guò)顯微鏡觀察它在細(xì)胞內(nèi)部的移動(dòng)