第二章細胞工程編輯ppt第二章細胞工程【知識目標】①了解制備植物細胞及微生物細胞的原生質體并進行細胞融合的根本方法。②學習進行動植物細胞及組織的培養(yǎng)方法。③認識單倍體植物的誘發(fā)及人工種子制備的根本要領。探討植物脫除病毒的途徑和檢測手段。④掌握利用動物體細胞克隆哺乳動物的根本做法及其重要意義。⑤領會干細胞芯康腦硨凸餉髑熬啊編輯ppt第三章細胞工程【技能目標】①學會描述植物組織培養(yǎng)、原生質體融合、動物細胞組織培養(yǎng)及細胞融合的根本過程。②掌握植物組織培養(yǎng)及快速繁殖的方法。編輯ppt第一節(jié)細胞工程概述一、細胞工程的根本概念細胞工程就是在細胞水平研究、開發(fā)和利用各類細胞的工程。細胞工程是一種細胞水平上的遺傳工程編輯ppt第一節(jié)細胞工程概述二、細胞工程根底知識細胞是細胞工程操作的主要對象。生物界有兩大類細胞：原核細胞與真核細胞。原核細胞如：細菌、放線菌等。真核細胞如：酵母、動植物等。原核細胞生長迅速，無蛋白質結合的DNA易于人們進行遺傳操作，是細胞改造的良好材料。編輯ppt第一節(jié)細胞工程概述三、細胞工程根本技術〔一〕無菌操作技術實驗操作應在無菌室內進行無菌室要求注意周圍環(huán)境的衛(wèi)生整潔超凈工作臺是最根本的實驗設備對生物材料進行徹底的消毒和除菌是實驗成功的前提編輯ppt第一節(jié)細胞工程概述三、細胞工程根本技術〔二〕細胞培養(yǎng)技術細胞培養(yǎng)是指動物、植物和微生物細胞在體外無菌條件下的保存和生長細胞培養(yǎng)步驟為：取材和除菌；配制細胞培養(yǎng)基，并對培養(yǎng)基進行滅菌或除菌；培養(yǎng)室培養(yǎng)編輯ppt第一節(jié)細胞工程概述三、細胞工程根本技術〔三〕

細胞融合技術1.制備原生質體2.誘導細胞融合3.篩選雜合細胞編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用一、植物組織培養(yǎng)〔一〕預備階段1.選擇適宜的外植體①大小要適宜。②同一植物不同部位的外植體，其細胞的分化能力、分化條件及分化類型有相當大的差異。③植物胚與幼齡組織器官比會化組織、器官更容易去分化，產生大量的愈傷組織。④不同物種相同部位的外植體其細胞分化能力可能大不一樣。編輯ppt編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用一、植物組織培養(yǎng)2.外植體的消毒滅菌外植體→自來水屢次漂洗→消毒劑處理→無菌水反復沖洗→無菌濾紙吸干。編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用一、植物組織培養(yǎng)3.配制適宜的培養(yǎng)基

組織培養(yǎng)基通常都包括三大類組分：①含量豐富的根本成分如蔗糖或葡萄糖高達每升30克，以及氮、磷、鉀、鎂等；②微量的無機物，如：鐵、錳、硼酸等；③微量有機物，如沖動素、吲哚乙酸、肌醇等。各培養(yǎng)基中，吲哚乙酸和沖動素的變動幅度很大，這主要因培養(yǎng)目的而異。編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用一、植物組織培養(yǎng)〔二〕誘導去分化階段器官切段去分化，培養(yǎng)基中應添加較高濃度的生長素類激素誘導外植體去分化可以采用固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)室中多層培養(yǎng)外植體外表除菌后，切成小片〔段〕插入或貼放培養(yǎng)基外表即可通常把它們置于人工照明條件下培養(yǎng)，以期得到綠色愈傷組織。編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用一、植物組織培養(yǎng)〔三〕繼代增殖階段愈傷組織長出后經過4~6周后〔四〕生根成芽階段胚狀體光照是本階段的必備外因〔五〕移栽成活階段編輯ppt編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用二、植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產〔一〕懸浮細胞培養(yǎng)系統(tǒng)編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用二、植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產〔二〕固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)1.平床培養(yǎng)系統(tǒng)編輯ppt編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用二、植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產〔二〕固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)2.立柱培養(yǎng)系統(tǒng)編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用二、植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產〔二〕固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)2.立柱培養(yǎng)系統(tǒng)①要選用高產細胞株系。②在營養(yǎng)液中參加目的產物的直接或近直接前體物質，往往對增產目的產物有特效。③對各類細胞的培養(yǎng)都應反復摸索碳源、氮源和生長調節(jié)物質的配比，找出最正確方案。④適量光照及通氣在多數情況下有利于產物的生成。編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用二、植物細胞培養(yǎng)和次生代謝物的生產〔二〕固定化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)以下簡要介紹褐藻酸鈣固定植物細胞的技術路線：編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用三、植物細胞原生質體制備與融合〔一〕原生質體的制備1.取材與除菌2.酶解3.別離4.洗滌5.鑒定編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用三、植物細胞原生質體制制備與融合〔二〕原生質體的融合1.化學法誘導融合聚乙二醇〔PEG〕結合高鈣高PH誘導融合法2.物理法誘導融合平行電極法編輯ppt編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用三、植物細胞原生質體制制備與融合〔二〕原生質體的融合融合處理后再生的細胞株將可能的類型：①完全的雜合植株②核質異源的植株③融合細胞由雙方胞質及一方核或再附加少量他方染色體或DNA片段構成。④原生質體融合后兩個細胞核尚未融合時就過早地被新出現的細胞壁分開。以后它們各自分裂生長成嵌合植株。編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用三、植物細胞原生質體制制備與融合〔三〕雜合體的鑒別與篩選1.雜合細胞的顯微鏡鑒別2.互補法篩選雜合細胞3.采用細胞與分子生物學的方法鑒別雜合體4.根據融合處理后再生長出的植株的形態(tài)特征進行鑒別編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用四、單倍體植物誘發(fā)與利用〔一〕花藥培養(yǎng)1.選取成熟度適中的花蕾或幼穗2.花藥預處理3.選擇適當的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件〔二〕花粉培養(yǎng)培育單倍體植株編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用四、單倍體植物誘發(fā)與利用〔三〕未授粉子房或胚珠的培養(yǎng)充滿希望的開展方向〔四〕雜交法獲單倍體植株〔五〕單倍體培養(yǎng)物的加倍可用0.2%~0.4%秋水仙素處理24~48h編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用五、人工種子的研制〔一〕人工種子的構成及特點1.人工種皮2.人工胚乳3.胚狀體編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用五、人工種子的研制突出的優(yōu)點：①可以不受環(huán)境因素制約②有利于保存該種系的優(yōu)良性狀；③本錢更低，更適合于機械化田間播種；④可根據需要在人工胚乳中添加適量的營養(yǎng)物、激素、農藥、抗生素、除草劑等編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用五、人工種子的研制〔二〕人工種子的制備1.胚狀體的制備及其同步生長〔1〕低溫法：〔2〕抑制劑法：〔3〕別離法：〔4〕通氣法：〔5〕滲透壓法：2.人工胚乳的制備

MS(或SH、White)培養(yǎng)基＋馬鈴薯淀粉水解物〔1.5%〕；SH培養(yǎng)基〔1∕2濃度〕＋麥芽糖〔1.5%〕3.配制包埋劑及包埋褐藻酸鈉編輯ppt人工種子包埋示意圖編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用五、人工種子的研制〔三〕人工種子的貯存與萌發(fā)迄今為止尚未攻克的難關。一般將人工種子保存在低溫〔4~7℃〕和枯燥〔相對濕度小于67%〕條件下編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用六、植物脫病毒技術〔一〕植物脫病毒途徑1.物理學方法2.化學方法3.生物學方法根本流程4.綜合脫毒法編輯ppt編輯ppt第二節(jié)植物細胞工程及其應用六、植物脫病毒技術〔二〕植物脫毒檢測1.外形觀察法2.電鏡觀察法3.免疫血清法編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用一、動物細胞培養(yǎng)動物細胞工程從細胞生物學和分子生物學的層次，根據人類的需要，一方面深人探索、改造生物遺傳種性，另一方面應用工程技術的手段，大量培養(yǎng)細胞、組織或動物本身，以期收獲細胞或其代謝產物以及可供利用的動物編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用二、動物細胞組織培養(yǎng)〔一〕細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)動物細胞一般步驟：①無菌取出目的細胞所在組織，以培養(yǎng)液漂洗干凈。②以鋒利無菌刀具割舍多余局部，切成小組織塊。③將小組織塊置解離液離散細胞〔解離液含蛋白酶類，無鈣、鎂離子〕。④低速離心洗滌細胞后，將目的細胞吸移至培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用二、動物細胞組織培養(yǎng)1.微導管培養(yǎng)法編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用二、動物細胞組織培養(yǎng)2.微載體培養(yǎng)法〔3〕微膠囊培養(yǎng)法編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用二、動物細胞組織培養(yǎng)〔二〕組織培養(yǎng)法①無菌操作取出目的組織，以培養(yǎng)液漂洗。②以鋒利無菌刀具割舍多余局部，將該組織分切成1~2mm2小塊，移人培養(yǎng)瓶。③加人適宜的培養(yǎng)基浸潤組織,小心地將培養(yǎng)瓶平翻180°，擱置15~30min，以利組織塊的貼壁生長。④翻回培養(yǎng)瓶，平臥靜置于37℃培養(yǎng)。編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用二、動物細胞組織培養(yǎng)〔三〕培養(yǎng)物的傳代〔四〕無血清培養(yǎng)三大局部：①根底培養(yǎng)基②基質因子③生長因子、激素和維生素編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用二、動物細胞組織培養(yǎng)〔五〕培養(yǎng)物的長期保存經典傳代法冷凍保存法液氮保存法為：①將成熟培養(yǎng)物〔細胞〕與5％~10％的甘油或二甲亞砜混勻，封裝于假設干個安甌瓶中；②緩慢降溫〔每分鐘1~3℃〕至一30℃；③繼續(xù)降溫〔每分鐘15~30℃／min〕至一150℃；④轉移至液氮凍存,可無限期保存。(六)細胞組織培養(yǎng)污染的防治編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用三、動物細胞融合〔一〕病毒誘導融合〔二〕化學誘導融合PEG誘導融合〔三〕電激誘導融合編輯ppt編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用四、單克隆抗體生產技術編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用五、細胞核移植與動物克隆〔一〕核移植1.異種核質關系研究2.脊椎動物克隆——細胞核遺傳全能性研究編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用五、細胞核移植與動物克隆〔二〕體細胞克隆“多莉〞綿羊是如何克隆誕生的呢？編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用五、細胞核移植與動物克隆〔二〕體細胞克隆意義①遺傳素質完全一致的克隆動物將更有利于開展對動物〔人〕生長、發(fā)育、衰老和健康等機理的研究。②有利于大量培養(yǎng)品質優(yōu)良的家畜。③經轉基因的克隆哺乳動物，將能為人類提供源源不斷的廉價的藥品、保健品以及較易被人體接受的移植器官。④科學家將很快地從目前的同種克隆技術推進到異種克隆編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用六、染色體轉移〔一〕微細胞介導法圖供體細胞→秋水仙素處理→低溫處理→細胞破碎→高速離心→收集染色體編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用六、染色體轉移①直接用微注射針向胞內注射染色體懸液。②將染色體與細胞共培養(yǎng)，染色體被細胞以胞吞的方式攝入。本法轉移成功率低。③將染色體與高濃度CaCl2混勻后滴加到受體細胞上，可提高成功率。④用卵磷脂與膽固醇混合液制成脂質體，將染色體包裹其中，再經聚乙二醇與受體細胞融合，到達轉移染色體的目的。編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用七、干細胞研究干細胞〔stemcell〕是動物〔包括人〕胚胎及某些器官中具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞，是重建、修復病損或衰老組織、器官功能的理想種子細胞。編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用七、干細胞研究三種類型：①全能性干細胞，即胚胎干細胞，是最原始的干細胞②多能性干細胞，發(fā)育潛能受到一定的限制。如：骨髓造血干細胞可分化成為至少12種血細胞，但一般不能分化出造血系統(tǒng)以外的其他細胞。③專一性干細胞，這類干細胞只能分化成一種類型或功能密切相關的兩種類型的細胞，如上皮組織基底層的干細胞和肌肉中的成肌細胞等。編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用七、干細胞研究干細胞具有以下顯著的特點：具有分裂成其他細胞的可能性；具有無限增殖分裂的潛能；可連續(xù)分裂幾代，也可在較長時間內處于靜止狀態(tài)；以對稱或不對稱兩種方式進行生長。編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用七、干細胞研究三個階段：①獲得干細胞系②建立干細胞誘導分化模型③將上述干細胞或干細胞培育體系植入動物或人的相應器官或組織，考察其效果。編輯ppt第三節(jié)動物細胞工程及其應用七、干細胞研究優(yōu)點：①低毒性〔或無毒性〕，一次治療有效；②不需要完全了解疾病發(fā)病確實切機制；③用于自身干細胞移植，可防止產生免疫排斥反響。編輯ppt編輯ppt編輯ppt第四節(jié)微生物細胞工程一、原核細胞的原生質體融合G+：①分別培養(yǎng)帶遺傳標志的雙親本菌株至指數生長中期②分別離心收集菌體，以高滲培養(yǎng)基制成菌懸液③混合雙親本，參加適量溶菌酶，作用20~30min；④高速離心后去上清液得原生質體，用少量高滲培養(yǎng)基制成菌懸液；⑤參加10倍體積的聚乙二醇〔40%〕促使原生質體凝集、融合；⑥數分鐘后，參加適量高滲培養(yǎng)基稀釋；⑦涂接于高滲選擇培養(yǎng)基上進行篩選。編輯ppt第四節(jié)微生物細胞工程一、原核細胞的原生質體融合對G+而言，在參加溶菌酶數分鐘后，應添加少量0.1mol／L的EDTA·Na2共同作用15~20min，那么可使90%以上的革蘭氏陰性細菌轉變?yōu)榭晒┘毎诤嫌玫那驙铙w。編輯ppt第四節(jié)微生物細胞工程二、真菌的原生質體融合真菌原生質體融合的要點以聚乙二醇為融合劑，在特異的選擇培養(yǎng)基上篩選融合子。只有那些形成真正單倍重組體的融合子才能穩(wěn)定傳代。具有雜合雙倍體和異核體的融合子遺傳特性不穩(wěn)定，需經多代考證和鑒定才能最后斷定是否為真正的雜合細胞。不少大型食用菌，如蘑菇、香菇、木耳、鳳尾菇和平菇等經細胞融合獲得一些新的性狀，取得了相當可觀的經濟效益。福建省輕工業(yè)研究所通過細胞融合獲得了耐高溫等性狀的蘑菇新品種。編輯ppt植物組織培養(yǎng)一、實驗目的了解離體無菌培養(yǎng)對實驗材料消毒、接種的要求，初步掌握取材、培養(yǎng)材料滅菌和接種等操作技術。編輯ppt植物組織培養(yǎng)二、實驗原理植物組織培養(yǎng)的理論依據是植物細胞具有全能性。即使是已經高度成熟和分化的細胞，也保持著恢復到分生狀態(tài)的能力。植物細胞表現出全能性的條件是脫離母體并具有適宜的生長條件。植物離體培養(yǎng)所需的營養(yǎng)是由培養(yǎng)基來提供的。在植物細胞脫分化和再分化的過程中，植物激素的調控至關重要。生長素和細胞分裂素的濃度和比例是控制植物離體培養(yǎng)細胞生長模式和器官發(fā)生的最重要的手段。編輯ppt植物組織培養(yǎng)三、實驗儀器超凈工作臺編