實(shí)驗(yàn)二血清γ球蛋白的分離純化與鑒定層析技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)思路實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng)層析技術(shù)1．層析法：又稱色譜法，是一種廣泛運(yùn)用的物質(zhì)分離純化、分析鑒定技術(shù).2.依據(jù)：混合物中各組分的理化性質(zhì)差異—吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。固定相—固定不動(dòng)

流動(dòng)相—對(duì)固定相作單向相對(duì)運(yùn)動(dòng)，推動(dòng)樣品中各組分通過固定相向前移動(dòng)。各組分理化性質(zhì)不同，對(duì)流動(dòng)相和固定相具有不同的作用力，因此在流動(dòng)相推動(dòng)樣品通過固定相的過程中，通過不斷地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各組分在固定相中的遷移距離不等，達(dá)到分離。3．基本原理：固定相和流動(dòng)相4．分類：

①流動(dòng)相的物理狀態(tài)：氣相和液相

→

氣液/固，液固/液

②方式：紙、薄層、柱

③原理：吸附、分配、凝膠、離子交換、親和、金屬螯合、疏水、反相5．凝膠層析

(凝膠過濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析)

①定義：指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相的層析柱時(shí)，混合物中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。②基本原理：

固定相：凝膠，惰性三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故稱分子篩，包括瓊脂糖、交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖-葡聚糖復(fù)合凝膠。

流動(dòng)相：洗脫液交聯(lián)葡聚糖凝膠多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)珠狀顆粒，商品名為SephadexG系列G—交聯(lián)度：G后面的阿拉伯?dāng)?shù)字表示不同的規(guī)格型號(hào)，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八種，具體含義為凝膠得水值的10倍或吸水量（g）/10g干膠交聯(lián)度與孔徑大小成反比：交聯(lián)度越大，孔徑越小，吸水性??；交聯(lián)度越小，孔徑越大，吸水性大。因此，“G”反映凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部范圍。長(zhǎng)鏈狀葡聚糖分子間以環(huán)氧丙烷連接凝膠層析的基本原理樣品加于柱上，樣品隨洗脫液的流動(dòng)而向下移動(dòng)，同時(shí)作垂直向下運(yùn)動(dòng)和不定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)→小分子可進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，流程長(zhǎng)，速度慢，后流出；大分子不能進(jìn)入凝膠空內(nèi)部，顆粒間移動(dòng)，流程短，先流出→大小分子彼此分開l分子大小不同混合物上柱；2洗脫開始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；3大小分子分開：4大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中數(shù)學(xué)模型VoViVtVi—凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）Vo—顆粒間水（外水）Vg—凝膠體積總體積Vt=Vi+Vo+VgKd—分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)Ve—洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積Ve=Vo+Kd·Vi

洗脫曲線：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度/吸光度為縱坐標(biāo)作圖（1）完全被排阻的極端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0<Kd<1（3）完全滲透的小分子，Ve=Vo+Vi，=1（4）吸附分子，Ve=Vo+Kd·Vi，Kd>1③影響因素*層析柱的選擇及裝填：柱大小—分離樣品量凝膠型號(hào)—分辨率：各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，有最大極限和最小極限。凝膠分離范圍之外的分子，難以分離。如大小不同的兩種全排阻分子/完全滲透分子。*洗脫液：溶解待分離物質(zhì)，不變性*加樣量：1%～5%*凝膠的再生交聯(lián)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)技術(shù)參數(shù)實(shí)驗(yàn)原理透析及超濾法鹽析、有機(jī)溶劑/免疫沉淀電泳凝膠層析離子交換層析超離心共性：

*生命高分子：透析、超濾、超離心、凝膠層析

*蛋白質(zhì)溶液是親水膠體：穩(wěn)定因素為水化膜和電荷→鹽析/有機(jī)溶劑沉淀

*兩性電解質(zhì)和等電點(diǎn)：pH>pI，蛋白質(zhì)帶負(fù)電；反之帶正電→電泳、離子交換層析

*有一定的功能：抗原性→免疫沉淀

個(gè)性：蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、親水程度、形狀不同分離依據(jù)：蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的和個(gè)性清蛋白pI=4.957%～72%α12%～5%α2pI<64%～9%β6.5%～12%γpI=7.32%～20%球蛋白實(shí)驗(yàn)思路分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定上午完成下午完成先粗后細(xì)①分段鹽析：常用中性鹽：硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨：溫度系數(shù)小，溶解度大，蛋白譜廣，分段鹽析效果好，不易引起變性。溶液pH約4.5～5.5，可用硫酸/氨水按需要調(diào)節(jié)pH值。分段鹽析：各種蛋白大小、親水程度、pI不同，所需的鹽濃度、pH也不一樣。如清蛋白分子小，親水性強(qiáng)，需高鹽濃度才沉淀，球蛋白分子大，親水性弱，較低鹽濃度即可沉淀。因此調(diào)節(jié)鹽濃度及pH可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。實(shí)驗(yàn)流程及操作注意事項(xiàng)影響因素：

①溫度：溫度與溶解度成正比。一般室溫即可,少數(shù)溫度敏感型蛋白質(zhì)需4度操作，而血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25度比0度時(shí)溶解度低，更易鹽析。

②pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在pI時(shí)溶解度最低。pH=pI效果更好。

③蛋白質(zhì)濃度：濃度高時(shí)產(chǎn)生共沉。鹽析前血清加等量生理鹽水稀釋，控制蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。②凝膠層析脫鹽：常用透析，需時(shí)較長(zhǎng)，最好低溫。也可用葡萄糖凝膠G-25/50過柱，用時(shí)較短。

固定相：sephadexG-25

流動(dòng)相：pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液（0.9%NaCl）

原理同前，蛋白質(zhì)大分子，硫酸銨小分子。

③濃縮：sephadexG-25吸水，利用高分子性質(zhì)。注意事項(xiàng)：

1．硫酸銨的滴加，邊搖邊逐滴加入

2．流洗柱子：3～4個(gè)柱長(zhǎng)

3．上樣：轉(zhuǎn)圈滴加，起跑線一致

4．防止柱上液層干涸

5．洗脫液收集無需分部，用載玻片檢測(cè)蛋白，無納氏試劑

6．G-2