自生固氮菌的分離純化一、目的要求：1、學(xué)習(xí)微生物純系分離、培養(yǎng)方法。2、掌握劃線分離純化微生物的方法。二、基本原理：為了生產(chǎn)和科學(xué)研究的需要，往往需要從自然界混雜的微生物群中分離單一的菌種，這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，可采用下列兩種方法：一種是提供有利于該微生物生長繁殖的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。如要從土壤中分離自生固氮菌，則其培養(yǎng)基中是不能含有N源，這種培養(yǎng)基就比較適于能利用空氣中坷的微生物。另一種方法是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制人們所不需要的微生物的生長繁殖。分離土壤中真菌，往往在分離真菌的馬丁培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)拿霞永t，鏈霉素和金霉素等化學(xué)藥品，目的在于抑制細(xì)菌生長，這樣更有利于獲得其純培養(yǎng)。土壤中微生物數(shù)量眾多，在肥沃土壤中固氮菌數(shù)量也很多，自然界中多數(shù)氮素養(yǎng)料是由微生物固氮的結(jié)果，固氮菌一般可分為自生固氮菌和共生固氮菌兩類。要分離自生固氮菌，常用阿斯畢無氮培養(yǎng)基這種選擇培養(yǎng)基，控制其適宜環(huán)境條件，使它在培養(yǎng)基上大量繁殖，然后通過稀釋法和劃線分離純化法，使它在培養(yǎng)基上形成單菌落，如分離

所得不純，需要進(jìn)一步純化，直到得到純種.三、材料與儀器1、培養(yǎng)基：阿斯畢無氮培養(yǎng)基。2、菜園土。3、滅菌培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、接種針、酒精燈等四、方法與步驟（一）富集培養(yǎng)：1、 用已滅菌后冷卻至50oC左右的阿斯畢培養(yǎng)基倒成平板。2、 用已滅菌的鑷子將黃豆粒大的菜園土擺入已冷凝的平板培養(yǎng)基上。3、正面放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，28oC培養(yǎng)3~4天后，在土粒周圍有混濁半透明的膠狀菌落出現(xiàn)，有的在后期會產(chǎn)生褐色的色素。（二）劃線分離純化:（下次實驗）1、用已溶化至50oC阿斯畢培養(yǎng)基倒入平板。2、用接種環(huán)挑取上述菌落少許，在冷凝平板上進(jìn)行劃線分離，而后置28oC培養(yǎng)4天。劃線方法如圖（三）純化、鏡檢，得到純種培養(yǎng)1、平板上出現(xiàn)單菌落，按無菌操作移入阿斯畢培養(yǎng)基斜面試管中，28oC培養(yǎng)4天。2、鏡檢：將斜面菌株進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。如是粗短桿狀或球狀的單一形態(tài)的菌體細(xì)胞較大，常呈單個或“8字”排列，在細(xì)胞表面有較厚的莢膜者，即為自生固氮菌。如有雜菌，需要進(jìn)一步劃線純化。3、將得到純化菌株，移接到另一阿斯畢培養(yǎng)基斜面管，28oC培養(yǎng)3~4天，即獲得純培養(yǎng)菌，可冷凍保存，備用。五、注意事項：（1） 在微生物分離、純化每一操作環(huán)節(jié)，要嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行。（2） 平板劃線