天然蜂蜜中淀粉酶的變化及碳穩(wěn)定同位素比值分析

一、儲藏過程對蜂蜜淀粉酶值和蛋白質含量的影響天然蜜蜂淀粉酶來自蜜蜂，而不是花粉和蜂蜜，表明天然蜜蜂淀粉酶是動物的來源。通常動物性酶的穩(wěn)定性較差,其活性極易受到外界溫度的影響,隨著時間的延長,活性下降。天然蜂蜜淀粉酶值和蛋白質含量在儲存過程中有相似的變化規(guī)律,即低溫時,淀粉酶值和蛋白質含量都基本保持不變,但是隨著儲存溫度提高和儲存時間延長,樣品的淀粉酶值和蛋白質含量迅速降低。在儲存過程中,天然蜂蜜淀粉酶值的變化與其蛋白質的變化密切相關,蛋白質在儲存過程中降解可能是天然蜂蜜淀粉酶值降低的直接原因。與天然蜂蜜相反,摻假蜂蜜的淀粉酶值和蛋白質含量基本不受儲存溫度及時間的影響,這與假蜂蜜中添加的工業(yè)淀粉酶(諾維信耐溫淀粉酶)的耐高溫特性密切相關。通過跟蹤測定蜂蜜的淀粉酶值變化可以判斷蜂蜜產品是否摻假,同時也可以判定天然蜂蜜產品的新鮮程度。二、碳穩(wěn)定同位素分析碳穩(wěn)定同位素比值是指在某一物質中碳的兩種同位素(12C、13C)的比值。不同的物質,其比值是不相同的。碳穩(wěn)定同位素比值分析法(SIRA)是近年來發(fā)展起來的現(xiàn)代分析方法,應用于鑒別蜂蜜的真?zhèn)魏陀嬎銚郊俚某潭?準確性高。測定穩(wěn)定性同位素比值可采用質譜分析(MS),質譜法是通過將樣品轉化為運動的氣態(tài)離子并按質荷比(m/z)大小進行分離記錄的分析方法。1、不同比例的蜂蜜中糖液c幾乎所有的蜜源植物屬C3植物,其!13C值大約在-28‰~-22‰之間,自然界中在這個范圍之外的蜜源植物寥寥無幾,而產生高果糖玉米糖漿(HFCS)的植物屬C4植物,其!13C值范圍為-20‰~10‰上述C3和C4兩類植物形成的碳水化合物(糖類物質)在化學上是相同的,但在兩種碳同位素比值上卻是不同的。當兩類碳水化合物混在一起時,這種混合物的碳同位素比值就會隨混合物的比例量而變化。利用這項技術分析大量人工制備的摻有不同比例高果糖玉米糖漿的蜂蜜樣品,通過對這些蜂蜜樣品測試結果的分析統(tǒng)計,得出結論是!13C值負于-23.5‰的蜂蜜則是沒有摻假的純正蜂蜜;δ13C值大于-21.5‰的蜂蜜,假蜜的概率為99.996%;而從-23.5‰到-21.5‰屬不能準確鑒定的“灰色區(qū)”,在這個區(qū)域內的蜂蜜可能是真的,也可能是假的。2、蜂蜜中糖代謝糖的檢測蜂蜜碳同位素第一檢驗方法解決了!13C值負于-23.5‰的純正蜂蜜和大于-21.5‰的假蜜之間的檢驗,但對-23.5‰到-21.5‰的“灰色區(qū)”仍無能為力。蜂蜜中另一種重要成分是蛋白質,研究結果表明,用蜂蜜蛋白質做內標物對“灰色區(qū)”蜂蜜中摻入高果糖玉米糖漿的鑒定是行之有效的。由于蛋白質需在蛋白酶的作用下生成肽和各種氨基酸,氨基酸需在一定的條件下發(fā)生脫羧或轉氨反應,才能生成碳水化合物。之后才能被酵母產生的糖酵解作用,最終逸出二氧化碳。這個反應過程比葡萄糖和果糖慢得多,就蜂蜜的!13C值而言,蜂蜜中蛋白!13C值比較穩(wěn)定,檢測效果更好,結果分析也很簡單,只要計算出蜂蜜蛋白!13C值減去蜂蜜!13C值的差值即可,這個差值叫做ISCIRA指數(shù)。當該指數(shù)為-1‰時,蜂蜜中存在7%的C4糖。這個指數(shù)越負,說明蜂蜜中摻入的C4糖越多,也就是摻入高果糖玉米糖漿(主要成分是果糖和葡萄糖)越多。三、蜂蜜的旋光度由于不同種類的蜂蜜都有相對穩(wěn)定的旋光度,一般為左旋。當摻入不同糖類后,蜂蜜的旋光度會發(fā)生變化,并隨摻糖濃度的不同而有規(guī)律的變化,摻入蔗糖的蜂蜜,隨著摻糖量的增加,其旋光度向右旋變化,摻入果糖或轉化糖后,其變化趨勢相反。通過測定其旋光度,判定蜂蜜的真?zhèn)我约皳郊俚臐舛?但是蜂蜜樣品pH及測定溫度均會影響測定值的準確性。因此,測定過程中應控制合適的溫度及pH,并使用醋酸鉛作為澄清劑,沉淀蛋白質等大分子物質。四、蜂蜜淀粉的提取蜂蜜中淀粉顆粒的出現(xiàn)率簡稱淀粉率是判斷蜂蜜中是否摻假的一個重要指標,淀粉率的高低是蜂蜜品質的標志之一。在純天然蜂蜜中存有少量的淀粉顆粒,一旦在蜂蜜中摻入飴糖或淀粉轉化糖后,存在大量淀粉顆粒,目前歐盟一些國家已明確規(guī)定進口蜂蜜中的淀粉率不得超過16.0%。該方法操作簡單,不需要特殊儀器設備,適宜推廣應用。稱取蜂蜜樣品20g(或40g)溶解于50mL蒸餾水,2500rpm離心10min傾去上清液,重復此步驟3次,將沉淀物移至錐形管再離心10min傾去上清液,以便充分洗去糖分,離心后使錐形管底部約剩0.05mL,加人1滴0.1N碘液靜置1min使沉淀物染色用滴管吹吸沉淀物10次以上。吸取1滴置于載玻片上,蓋上蓋玻片,用400倍顯微鏡鏡檢l0個視野。蘭色顆粒為淀粉粒,分別記下每個視野中花粉數(shù)和淀粉數(shù):淀粉率(%)=淀粉顆粒數(shù)(10個視野的總數(shù))×100%/[淀粉顆粒數(shù)(10個視野)+花粉顆粒數(shù)(10個視野)]五、不同蜜源蜂蜜氨基酸組分的檢測采用氣相色譜、氣液色譜、高壓液相色譜、反向高效液相色譜、毛細管氣相色譜等方法分析測定蜂蜜中的殺蟲劑、殺螨劑、蜜蜂驅避劑及其代謝產物的殘留量;分析蜂蜜中的糖分,包括葡萄糖、果糖、蔗糖、松二糖、麥芽糖、海藻糖、異麥芽糖、黑曲霉糖、曲二糖,松三糖以及甘露蜜中的棉籽糖等;利用氣相色譜、高壓液相色譜等色譜法測得蜂蜜中的精氨酸、色氨酸、亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸等氨基酸成分,并根據(jù)不同蜜源蜂蜜的氨基酸含量的差異來鑒別蜂蜜的植物來源;采用木炭柱、薄層層析法、高效液相色譜法等方法對糖漿摻假進行檢測,薄層色譜法可檢出的高果糖漿含量至5%水平,用帶脈沖電流檢測器的陰離子交換液相色譜檢測蜂蜜中攙高果糖玉米糖漿和轉化糖漿,通過高效液相色譜檢測蜂蜜中麥芽糖與異麥芽糖的比例可確定蜂蜜是否摻糖漿。六、蜂蜜金屬元素的分析常見的光譜法分析有:原子吸收光譜分析、原子發(fā)射光譜分析、可見分子吸收光譜分析、紫外分子吸收光譜分析、紅外分子吸收光譜分析和分子熒光分析等方法。用火焰原子吸收光譜法可分析蜂蜜中的金屬元素,如鈣、鎂、鋅等;紫外分光光度法可測定蜂蜜中的羥甲基糠醛含量(HMF,評價蜂蜜新鮮度重要指標);利用核磁共振波譜分析(NMR)對蜂蜜中微量元素、農藥及抗生素殘留進行檢測,用13C-NMR光譜法可對蜂蜜中結構相似的二糖進行定性和定量分析,用衍生分光光度法可測定蜂蜜雙甲脒、土霉素、脫氧土霉素等有害物質的殘留。七、蜂蜜表面電化學分析電化學分析法是根據(jù)被測物質溶液的各種電化學性質(電極電位、電流、電量、電導或電阻等)來確定其組成及其含量的分析方法。它通常靈敏度和準確度都很高,適用面廣。由于在測定過程中得到的是電學信號,因此易于實現(xiàn)自動化和連續(xù)分析。電化學分析法包括電位測定、電導測定、電容量分析、電解分析等方法?？衫秒娀瘜W法可測定蜂蜜糖類及酚類化合物。近年來,國內蜂蜜造假已向規(guī)?；⑹袌龌l(fā)展,假蜂蜜占蜂蜜市場的比率越來越大,造假技術呈現(xiàn)出專業(yè)化,國家質檢總局和國家標準化管理委員會發(fā)布新的《國家蜂蜜標準》已在生產領