質(zhì)粒DNA及入DNA的酶切、連接、轉(zhuǎn)化及重組子的篩選鑒定一、【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、 學(xué)習(xí)在實(shí)現(xiàn)DNA的體外重組過(guò)程中，如何正確選擇合適的載體和限制性核酸內(nèi)切酶，并利用限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)載體和目的DNA進(jìn)行切割；2、 學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)構(gòu)建重組DNA的基本方法并掌握載體和目的DNA酶切的操作技術(shù)；3、 學(xué)習(xí)利用T4-DNA連接酶連接載體片段和目的DNA片段，構(gòu)建體外重組DNA；4、 掌握利用CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞的原理與方法和熱擊法轉(zhuǎn)化的原理和方法；5、 學(xué)習(xí)并掌握使用紅白菌落法篩選獲得重組子以及邁補(bǔ)篩選法的原理及方法；6、 學(xué)習(xí)并掌握使用試劑盒抽提質(zhì)粒的方法及進(jìn)一步確定重組質(zhì)粒中含有外源目的DNA片段。二、【實(shí)驗(yàn)原理】本階段實(shí)驗(yàn)采用單酶切法，用限制性核酸內(nèi)切酶HindIII將上階段實(shí)驗(yàn)中提取并用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了的大腸桿菌質(zhì)粒DNApUC19和買來(lái)的入DNA同時(shí)酶切,然后用DNA連接酶將上述酶切的質(zhì)粒pUC19和入DNA在有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中連接起來(lái)，得到重組質(zhì)粒。之后再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到用CaCl2處理的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)培養(yǎng)后，再將這些大腸桿菌涂布在麥康凱培養(yǎng)基中，通過(guò)a互補(bǔ)篩選法，根據(jù)菌洛顏色篩選出重組子，并將其劃線接種于加入氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基中進(jìn)行驗(yàn)證，最后大量培養(yǎng)，并用試劑盒提取重組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1、限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的酶。主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。根據(jù)1994年美國(guó)出版的《分子生物學(xué)百科全書》的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，僅II型核酸內(nèi)切限制酶一項(xiàng)就已從各種不同的微生物當(dāng)中，分離出了2300種以上、可識(shí)別230種不同的DNA序列。在核酸內(nèi)切限制酶的作用下，侵入細(xì)菌的“外源”DNA分子便會(huì)被切割成不同大小的片段，而細(xì)菌自己固有的DNA由于修飾酶（通常是一種甲基化酶）的保護(hù)作用，則可免受限制酶的降解。目前已經(jīng)鑒定出3種不同類型的核酸內(nèi)切限制酶，即I型酶、II型酶和III型酶。II型核酸內(nèi)切限制酶具有3個(gè)基本的特性：①在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位切割DNA分子，產(chǎn)生鏈的斷裂；②2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相對(duì)的；③斷裂結(jié)果形成的DNA片段往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。限制性內(nèi)切酶的切割方式：根據(jù)切割位點(diǎn)相對(duì)于對(duì)稱軸的位置而言有三種，在對(duì)稱軸5'側(cè)切割產(chǎn)生5'粘端，在對(duì)稱軸的3'側(cè)切割產(chǎn)生3'粘端，在對(duì)稱軸處切割產(chǎn)生平端。核酸內(nèi)切限制酶對(duì)DNA底物的酶解作用是否完全，直接關(guān)系到連接反應(yīng)、重組體分子的篩選和鑒定等實(shí)驗(yàn)結(jié)果。核酸內(nèi)切限制酶活性的充分發(fā)揮受到以下幾個(gè)因索的影響：1）DNA樣品的純度，2）DNA的甲基化程度，3）酶切消化反應(yīng)的溫度，4）DNA的分子結(jié)構(gòu)，5）核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液。內(nèi)切酶的星號(hào)活性：內(nèi)切酶通常有嚴(yán)格的識(shí)別特異性，能精確地識(shí)別Dna排列順序。但在某些反應(yīng)條件下，識(shí)別順序的特異性可能發(fā)生變化。結(jié)果一種內(nèi)切酶酶切同一種DNA片段會(huì)產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，得到不同的酶切片段，這就是內(nèi)切酶的星號(hào)活性。最常見的例子是EcoRI,—般條件下它識(shí)別GAATTC六個(gè)核苷酸順序，而EcoR1（表現(xiàn)有星號(hào)活性），僅能識(shí)別AATT四個(gè)核苷酸的順序。在這種條件下的酶解反應(yīng)，電泳后出現(xiàn)的DNA條帶數(shù)可能增多。促使內(nèi)切酶產(chǎn)生星號(hào)活性的因素有多種，主要由如下一些因素引起：（1）甘油濃度過(guò)高。這是引起星號(hào)反應(yīng)的常見原因。（2）離子強(qiáng)度不合適。鹽濃度降低也可能引起星號(hào)反應(yīng)。（3）陽(yáng)離子變化。若將Mg2+改為Mn2+可能促使EcoRI和HindIII產(chǎn)生星號(hào)活性。（4）溶液中pH變化。如用EcoRI酶切時(shí)，反應(yīng)溶液的pH值由7.5升高到8.5時(shí)也會(huì)出現(xiàn)星號(hào)反應(yīng)。（5）有機(jī)溶劑殘留的影響。2、酶切方法體外構(gòu)建重組DNA分子，首先要了解目的基因的酶切圖譜，選用的限制性核酸內(nèi)切酶都不能在目的基因內(nèi)部有專一的識(shí)別位點(diǎn)，即當(dāng)用一種或者兩種限制性核酸內(nèi)切酶切割外源供體DNA時(shí)，能夠得到完整的目的基因。其次，選擇具有相應(yīng)的單一酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒、噬菌體等載體分子再為克隆的載體。常用的酶切方法有雙酶切法和單酶切法兩種。3、DNA連接酶1967年，世界上有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化2條DNA分子之間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶（ligase）。這種酶能夠參與DNA裂口的修復(fù)，在一定條件下還能連接DNA分子的自由末端。連接的功能是通過(guò)合成相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而修復(fù)缺口（nick）或單鏈的裂口（gap）。DNA連接酶能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3'羥基末端與5'磷酸基團(tuán)末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于連接DNA片段的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。DNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，不能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接。T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接，但平末端之間連接的效率比較低。DNA連接酶同核酸內(nèi)切限制酶一樣，都是在體外構(gòu)建重組DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸內(nèi)切限制酶可以將DNA分子切割成不同大小的片段，然而要將不同來(lái)源的DNA片段組成新的雜種DNA分子，還必須將它們彼此連接起來(lái)。目前有3種體外連接DNA片段的方法：①用DNA連接酶連接具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段;②用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來(lái)，或是用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾之后，再用DNA連接酶連接起來(lái)；③先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端，再用DNA連接酶連接起來(lái)。這3種方法雖然互有差異，但共同的一點(diǎn)都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。4、連接反應(yīng)外源DNA片段與載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術(shù)，主要依賴于核酸內(nèi)切限制酶和DNA連接酶催化完成的。DNA連接酶催化兩雙鏈DNA片段相鄰的5'-磷酸和3'-羥基間形成磷酸二酯鍵。在分子克隆中最有用的DNA連接酶是來(lái)自T4噬菌體的DNA連接酶：T4-DNA連接酶，該酶需要ATP作為輔助因子。5、感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化構(gòu)建好的重組DNA轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的現(xiàn)象就是轉(zhuǎn)化。能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞必須是感受態(tài)細(xì)胞，即受體細(xì)胞最容易接受外源DNA片段實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)，它決定于受體菌的遺傳特性，同時(shí)與菌齡、外界環(huán)境等因素有關(guān)。人工轉(zhuǎn)化是通過(guò)人為誘導(dǎo)的方法使細(xì)胞具有攝取DNA的能力，或人為地將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，該過(guò)程與細(xì)菌自身的遺傳控制無(wú)關(guān)，常用熱擊法，電穿孔法等。能否實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化還與受體細(xì)胞的遺傳特性有關(guān)，所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)的缺陷變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2法，制備好的感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為15%的無(wú)菌甘油，-70°C可保存半年至一年。經(jīng)過(guò)CaCl2處理的細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，允許外源DNA分子進(jìn)入。在低溫下，將攜帶有外源DNA片段的載體與感受態(tài)細(xì)胞混合，經(jīng)過(guò)熱擊或電穿孔技術(shù)，使載體分子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的外源DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將這些轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出重組子。本實(shí)驗(yàn)以E.coliDH5a菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理，使其處于感受態(tài)，然后將重組后的PUC19質(zhì)粒在42C下熱擊90s，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。6、重組子的篩選鑒定重組DNA轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞后，并非所有的受體細(xì)胞都能被導(dǎo)入重組DNA分子，一般僅有少數(shù)重組DNA分子能進(jìn)入受體細(xì)胞，同時(shí)也只有極少數(shù)的受體細(xì)胞在吸納重組DNA分子之后能良好增殖。并且它們是與其他大量未被轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞混雜在一起。再者，在這些被轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中，除部分含有我們所期待的重組DNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個(gè)載體與多個(gè)外源DNA片段形成非期待重組DNA分子導(dǎo)入所致。因此必須使用各種篩選及鑒定手段區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子，并從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體中分離出帶有目的基因的重組子。本實(shí)驗(yàn)中采用的方法是平板篩選法和電泳檢測(cè)?？顾幮院Y選主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選，而不含重組質(zhì)粒DNA分子的受體菌則不能存活，質(zhì)粒pUC19攜帶有氨芐青霉素抗性基因，在含有氨芐青霉素平板上篩選轉(zhuǎn)化子。沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒PUC19的受體細(xì)胞，在含有氨芐青

霉素的平板上不生長(zhǎng)。a互補(bǔ)篩選法根據(jù)菌落顏色篩選含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，利用B-半乳糖苷酶篩選系統(tǒng)來(lái)選擇。載體上帶有一個(gè)來(lái)自大腸桿菌的lac操縱子的DNA區(qū)段,這一區(qū)段編碼B-半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)蛋白片段°IPTG（異丙基-B-D-硫代半乳糖苷）可以誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的B-半乳糖苷酶羧基端的一個(gè)蛋白片段互補(bǔ)（a互補(bǔ)）。故暴露于誘導(dǎo)物IPTG的細(xì)菌含有編碼lacZ基因的質(zhì)粒可同時(shí)合成該酶的兩種片段，該菌在麥康凱培養(yǎng)基上利用乳糖產(chǎn)酸生成紅色菌落。將多克隆位點(diǎn)克隆入B-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插人質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后可使B-半乳糖苷酶氨基端片段滅活，從而破壞了a互補(bǔ)作用。帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。利用這種篩選方法可方便地將含目的基因的重組子篩選出來(lái)。挑選在氨芐青霉素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的白色菌落，通過(guò)擴(kuò)增培養(yǎng)。因?yàn)樵S多菌落存在假陽(yáng)性情況，在氨芐青霉素培養(yǎng)基上的白色菌落可能是導(dǎo)入的重組載體DNA菌落，也可能是載體自連后發(fā)生突變的菌落，所以還要鑒定轉(zhuǎn)化子中重組質(zhì)粒DNA分子的大小，可將重組的載體DNA提取出來(lái)，進(jìn)行后續(xù)的酶切、電泳檢驗(yàn)。如下圖為質(zhì)粒pUC19酶切圖譜：2686怕kby質(zhì)粒pUC19的酶切圖譜分析2686怕kby質(zhì)粒pUC19的酶切圖譜分析pucw^il(2.686kb)Hindi￡cgRIKpntBa/nHlAccWPsflHtndill■■■■1■SadXma\XoalOspMISphlSmal*Polylinkef三、【實(shí)驗(yàn)材料及儀器】菌株：E.coliDH5a培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基（加入氨芐青霉素）試劑材料：酶切反應(yīng)：（DNAPUC19質(zhì)粒，酶切l(wèi)Oxbuffer,HindIII,重蒸水，久DNA。）連接反應(yīng)：（酶切后的DNAPUC19質(zhì)粒和久DNA，連接lOxbuffer,T4連接酶,重蒸水。）感受態(tài)細(xì)胞的制備：（0』Caj）轉(zhuǎn)化：（連接液和感受態(tài)細(xì)胞，0.1MCaCl2，冰塊。重組菌的挑選、檢驗(yàn)：試劑盒（含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer），酶切后的DNAPUC19質(zhì)粒，試劑盒抽提的DNA,酶切l(wèi)Oxbuffer,HindIII,重蒸水，瓊脂糖，TAE緩沖液。上樣緩沖液，EB染液。4.儀器器材：20、200、lOOOul的槍和槍尖，1.5ml的Ep管，恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋,平板,三角瓶,試管,接種環(huán),牙簽,酒精燈,火柴,冰箱,離心機(jī)，電泳槽，紫外儀，PCR擴(kuò)增儀四、【實(shí)驗(yàn)步驟】（一）酶切1、在1.5ml的Eppendorf管中依次加入酶切反應(yīng)的各種成分，混勻，適當(dāng)離心，使樣品集中于管底；酶切反應(yīng)各成分添加如表1：表1pUC19質(zhì)粒及2DNA酶切反應(yīng)體系載體DNA（pUC19質(zhì)粒）目的DNA(ADNA)試劑體積/uL試劑體積/uLddH2O7.5ddH2O20pUC195ADNA5Hindi核酸內(nèi)切酶1Hindi核酸內(nèi)切酶210*Buffer1.510*Buffer3反應(yīng)體系總體積15反應(yīng)體系總體積30注意：加樣的順序應(yīng)該是，先加ddH20，其次是10*Buffer和DNA，最后加酶。且前幾步要把樣品加到管底的側(cè)壁上,加完后將其甩到管底,而酶液要在加入前從-20C的冰箱取出，并酶管放置冰上，取酶液時(shí)吸頭應(yīng)從表面吸取,防止由于插入過(guò)深而使吸頭外壁沾染過(guò)多的酶液。取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合液的液面以下,并充分混勻。限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)屬于微量

操作技術(shù)，無(wú)論是DNA樣品還是酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性并確保樣品和酶全部加入反應(yīng)體系。此外，酶切反應(yīng)的所有塑料制品（Eppendorf管、吸頭等）必須是新的，并經(jīng)過(guò)高溫滅菌，操作時(shí)打開使用，操作過(guò)程不要求無(wú)菌，但要注意手和空氣中雜酶的污染，因此要求環(huán)境干凈，戴手套操作，盡量減少走動(dòng)，縮短Eppendorf管的開蓋時(shí)間。2、 將上述反應(yīng)體系在37°C恒溫水浴鍋中反應(yīng)1h以上。3、 采用瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切結(jié)果4、 質(zhì)粒DNA、入DNA的酶切瓊脂糖電泳結(jié)果及分析94164369123456789101112131415161794164369入入DNA/HindIII酶切電泳圖分析：從左到右各泳道分別為第一泳道：PUC19質(zhì)粒第二、十五、十六、十七泳道：用Hindill酶切完的入DNA第三至第十四泳道：第1至第12小組Hindill酶切的pUC19質(zhì)粒分析：我在第一組，所點(diǎn)樣品在第三泳道，依稀可見三條帶，從上而下依次為帶1、帶2、帶3。對(duì)比酶切的入DNA,可知帶①在2.6Kb左右，而且?guī)?在第一泳道雙螺旋質(zhì)粒pUC19上方，據(jù)此判斷帶①為線性pUC19質(zhì)粒；而帶②基本上在雙螺旋pUC19質(zhì)粒位置，因此帶②為未切開的雙螺旋pUC19質(zhì)粒。帶3位于凝膠底部呈現(xiàn)比較模糊的連續(xù)帶可能為未降解的小RNA分子。對(duì)比帶1和帶2發(fā)現(xiàn)，帶1的亮度明顯比帶2大，說(shuō)明酶切較為徹底，至少有60%的pUC19已被酶切，可進(jìn)行接下來(lái)的連接操作。但是我這組的帶1明顯比第4、5、6、7、9、11、12組同學(xué)的帶1暗，原因是我組在實(shí)驗(yàn)第一階段提取的pUC19質(zhì)粒樣品濃度較低。二）連接

1、在500ul的Eppendorf管中依次加入連接反應(yīng)的各種成分，混勻，可適當(dāng)離心，使樣品集中于管底；連接反應(yīng)各成分添加如下表2:表2連接反應(yīng)體系試劑體積/uL入DNA/HindIII2.0pUC19DNA/HindIII2.010*LigaseBuffer1.0ddH2O4.0T4-DNA連接酶1.0連接反應(yīng)體系總體積10.0注意：加樣順序和酶切反應(yīng)時(shí)一樣，先加ddH20,其次是10*Buffer和DNA,最后加酶2、在16°C的恒溫水浴鍋中過(guò)夜反應(yīng)三） 感受態(tài)細(xì)胞的制備1、用接種環(huán)從含有E.coliDH5a的培養(yǎng)基平板上挑取少量E.coli菌落接種到20mlLB液體培養(yǎng)基里，37C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。接種過(guò)程及以下的轉(zhuǎn)接操作均須嚴(yán)格無(wú)菌操作，以防污染。2、 從振蕩培養(yǎng)箱中取出37C過(guò)夜培養(yǎng)物，此時(shí)的培養(yǎng)物較渾濁，顏色變深。按1%的接種量吸取200山轉(zhuǎn)接到20mlLB培養(yǎng)基中，37C振蕩培養(yǎng)2—3小時(shí)。注意吸取前應(yīng)充分混勻菌液，使吸取的菌量足夠。培養(yǎng)完成后，分別取1.5ml菌液于2個(gè)無(wú)菌的1.5mlEppendorf管中，5000rpm離心5min,棄上清液，如此重復(fù)收集菌體一次，使菌量增多。離心完后，棄上清液，吸干。3、 每支離心管中加入用冰預(yù)冷的1000ul0.1mol/lCaCl2溶液，漩渦震蕩使細(xì)胞懸浮混勻，冰上放置15min,4C5000rpm離心5min；棄上清液，吸干，加入100ulCaCl2懸浮冰浴。其中吸干上清可用200ul量程槍尖達(dá)到較好吸干效果,如果用1000ul槍尖則容易將菌體吸入槍尖內(nèi),造成菌體量的損失。四） 轉(zhuǎn)化1、取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液，搖勻，分別從中吸取50ul、50ul、100ul置于三個(gè)新的，已滅菌的Eppendorf管中，并編號(hào)為1、2、3,往2號(hào)Eppendorf管中加入2ul質(zhì)粒Puc19，混勻。3號(hào)Eppendorf管中加入之前連接步驟中制備好的連接液?；靹?。然后將這三個(gè)Eppendorf管冰浴30min；2、 30min后，將上述三個(gè)Eppendorf管取出，置于42C水浴中熱擊2min,然后迅速置于冰上，冰浴5min,此時(shí)質(zhì)粒已經(jīng)吸附到感受態(tài)細(xì)胞的表面，不能劇烈振蕩，以增加轉(zhuǎn)化效率；3、 向上述3管中分別加入500ulLB液體培養(yǎng)基，37C搖床培養(yǎng)1h,使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)。注意每次加LB液體時(shí)均需換槍尖，防止雜菌污染感受態(tài)細(xì)胞。五） 稀釋和涂布平板1、無(wú)菌操作，將轉(zhuǎn)化細(xì)胞溶液按以下分組涂布平板：（1）受體菌對(duì)照管：取100ul受體菌液分別涂布含有氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上；（2）pUC19質(zhì)粒對(duì)照組：取20ul、100ul培養(yǎng)液涂布于含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基；（3）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組：取20ul、50ul、100ul、150ul、200ul培養(yǎng)液分別涂布含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基，2、 當(dāng)菌液完全被培養(yǎng)基吸收后（大約10min）倒置培養(yǎng)皿，于37°C恒溫培養(yǎng)24~36h,觀察菌落生長(zhǎng)情況（紅白菌落法）。3、 結(jié)果統(tǒng)計(jì)及分析。各培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)情況如下表：各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)皿內(nèi)菌落生長(zhǎng)狀況組別不含Amp培養(yǎng)基含Amp培養(yǎng)基結(jié)果說(shuō)明受體菌對(duì)照組有大量白色菌落生長(zhǎng)無(wú)菌落生長(zhǎng)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)氨芐青霉素敏感PUC19質(zhì)粒對(duì)照組-有大量紅色菌落生長(zhǎng)PUC19質(zhì)粒已導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，使其抗青霉素重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組有大量紅色菌落生長(zhǎng)，少數(shù)白色菌落生長(zhǎng)目的基因已插入質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，破壞a互補(bǔ)作用，從而生成白色菌落根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我組之前連接的重組質(zhì)粒已基本上轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)預(yù)期基本一致。六）重組子的篩選與鑒定1、取一個(gè)含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基平板，在底部劃線分成2個(gè)區(qū)域；在涂有重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化組的平板上分別選取2個(gè)單個(gè)的白色轉(zhuǎn)化子，用接種針劃線轉(zhuǎn)接到平分成2份的含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上；37C過(guò)夜培養(yǎng)；3、分別取3ml菌液，用Omega試劑盒抽提重組質(zhì)粒DNA,具體步驟見說(shuō)明書；4、瓊脂糖凝膠電泳鑒定。帶1帶2DL5000DNAmarker56423I3J941B66574J61入DNA/Hindm對(duì)照?qǐng)D從左至右各泳道依次為:第一泳道:未酶切的質(zhì)粒pUC19第二泳道：入DNA/Hindlll第三至第十四泳道：第一組至第12組提取的重組質(zhì)粒第十五泳道:入DNA/Hindlll第十六泳道：DL5000DNAmarker第十七至第二十五泳道：各組提取的重組質(zhì)粒分析:（1）我們組提取的樣品點(diǎn)在第三泳道，與圖1：從左至右依次為分析:（1）我們組提取的樣品點(diǎn)在第三泳道，與圖1：從左至右依次為pUC19、入DNA/Hindis、第3、4、5、9、11、13泳道樣品、入DNA/HindmarkerHI、DL5000DNA圖2：從左至右依次為第六、七、564bp，與插入片段大小非常接近。另外，重組質(zhì)粒亮度與質(zhì)粒pUC19的亮度相比，重組質(zhì)粒的亮度約為其5倍，質(zhì)粒pUC19的量為200nq，則重組質(zhì)粒的量可判斷為200*5=1000nq，重組質(zhì)粒濃度為1000/4=250nq/ul。不過(guò)，其中第九泳道樣品亮度比本組其它樣品亮度稍小，其重組質(zhì)粒濃度也應(yīng)較小，大約為180nq/ul。（2）第六、七、八、二十泳道的樣品電泳結(jié)果各條帶基本在同一水平線上，從上往下可見兩條比較明顯的帶，依次為帶1,帶2（如圖2）。與入DNA/Hindlll對(duì)照?qǐng)D相比可知帶1大小約為9.5kb，判斷其為被酶切開而沒(méi)有連接上的入DNA片段，它的亮度較小，推知其濃度較小。帶2大小約為5.1kb，且它的亮度很大，推知帶2就是這些組同學(xué)們提取的八、二十泳道樣品、入DNA/Hind皿、DL5000DNAmarker第四、五、九、十一、十三、二十五泳道的樣品基本在一條水平線上，帶型亦相似，依稀可見三條帶（如圖1）。從上而下依次為帶1、帶2、帶3。帶1很暗，大致在入DNA/Hindill的第三條帶稍下方，可判斷帶1大小約為5.8kb,帶2較窄，較暗，估測(cè)其大小為4.5kb，帶3最寬，也遠(yuǎn)比帶1，帶2亮，應(yīng)該就是我們所要提取的重組質(zhì)粒，它大致與入DNA/Hindlll的第五條帶稍上方平齊，與DL5000DNAmarker的第二、三條帶的中間地帶平齊，據(jù)此可判斷其大小約為2.5kb，而空載體質(zhì)粒pUC19的大小約為1.9kb，由此判斷插入片段大小約為2.5—1.9=0.6kb左右，可初步判斷插入片段為入DNA/Hindlll電泳圖譜中的第七條帶，其大小為重組質(zhì)粒，那么，這些重組質(zhì)粒中所插入的外源片段大小為5.1-1.9=3.2kb，而入DNA/Hindlll酶切圖譜中沒(méi)有3.2kb的條帶，故不可判斷出插入片段為哪段。根據(jù)它的亮度約為pUC19條帶亮度的4倍，據(jù)此可知，第四、五小組同學(xué)所提取的重組質(zhì)粒濃度約為（200*5）/4=250nq/ul，而第六、二十組同學(xué)的樣品亮度略大于第四、五組的，約為他們的1.5倍，于是他們組的重組質(zhì)粒濃度為375nq/ul。（3）第十二、十四、十八、十九、二十一、二十二泳道的電泳結(jié)果大致相同（如圖3）。其中最亮的那條帶與第一泳道的空載體本在一水平線上，可初步判定它們是未連入外源DNA的質(zhì)粒圖3：從左至右依次為帶12、14圖3：從左至右依次為帶12、14、18、19、21、22、入DNA/HindIU、DL5000DNAmarker>質(zhì)粒pUC19可見亮條帶，帶1,帶2(如圖4。帶2明顯比帶1亮，大小約為3.1kb,可判斷為重組質(zhì)粒，插入片段大小可計(jì)算為3.1kb-1.9kb=1.2kb，入DNA/Hindlll酶切圖譜中沒(méi)有1.2kb的條帶，故不可判斷出插入片段為哪段。將它的亮度與質(zhì)粒PUC19帶的亮度相比，前者約為后者的6倍，可計(jì)算重組質(zhì)粒濃度約為(6*200)/4=300nq/ul。(如圖4)為