第五章

目的基因的制備一、目的基因的概念二、獲得目的基因的方法三、目的基因用途2023/10/21一、目的基因的概念外源基因:插入到載體上并導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)的特定基因或DNA片段，稱為外源基因。目的基因：通常將那些已被或者準(zhǔn)備要被分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的特定基因或DNA片段，稱為目的基因。2023/10/22目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)(酶)的結(jié)構(gòu)基因，諸如抗逆性相關(guān)基因、生物藥和保健品相關(guān)基因、毒物降解相關(guān)基因以及工業(yè)用酶相關(guān)基因等。隨著生物長(zhǎng)期的進(jìn)化，生物界積累了大量對(duì)人類有用的基因。它是大自然恩賜于人類的寶貴資源，等待人們?nèi)ラ_發(fā)利用。2023/10/23二、獲得目的基因的方法直接分離法逆轉(zhuǎn)錄法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR法)鳥槍法人工化學(xué)合成法基因文庫法(基因組文庫、cDNA文庫)mRNA差異顯示法2023/10/24㈠鳥槍法

鳥槍法：是將基因組全部打亂,切成碎片,進(jìn)行隨機(jī)測(cè)序,測(cè)序后再將它們拼接起來，進(jìn)而獲得目的基因的方法。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。2023/10/25鳥槍法的優(yōu)點(diǎn)：速度快，簡(jiǎn)單易行，成本較低，并能獲得與天然基因組DNA一親的有內(nèi)含子的基因DNA片段。鳥槍法克隆目的基因的缺點(diǎn)補(bǔ)平基因缺口困難排序拼裝麻煩，工作量較大專一性較差需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)2023/10/26鳥槍法制備目的基因的主要步驟①染色體DNA的切斷超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端全酶切：片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控部分酶切：片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整②DNA片段與載體連接如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體2023/10/27③重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞④篩選含有目的基因的目的重組子菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）2023/10/28㈡直接分離法

2023/10/29⑴限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法：

①對(duì)已知序列的DNA分子，只需用已知識(shí)別序列的限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行一次或幾次切割，分離純化所需DNA片段，與適當(dāng)載體重組后轉(zhuǎn)化受體菌后即可得到目的基因的克隆。

②對(duì)已知定位的目的基因，只要根據(jù)目的基因兩側(cè)的已知的限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割，一次就可獲得目的基因。③即使含目的基因的DNA分子未定序或無定位，也只須先通過酶切分析，隨后再通過部分酶切，克隆構(gòu)建一個(gè)非常簡(jiǎn)單的基因組文庫，從中釣出目的基因。

2023/10/210⑵基因分離的物理化學(xué)法這是基因工程在發(fā)展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用該法分離獲得的?；驹硎荄NA分子的兩條鏈存在著G≡C、A=T堿基配對(duì),其中GC間存在3個(gè)氫鍵，AT間存在2個(gè)氫鍵。不同基因片段的堿基組成差異較大，其理化性質(zhì)，如浮力密度和解鏈溫度等也有明顯不同，采用適當(dāng)方法可從基因組分離出目的基因。物理化學(xué)法分離目的基因的方法主要有密度梯度離心法、單鏈酶解法和分子雜交法等。

2023/10/211㈢基因的化學(xué)合成化學(xué)合成DNA的實(shí)質(zhì)是按照序列要求將脫氧核苷酸單體一個(gè)個(gè)接上去，每接一個(gè)單體就是一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，包括：基團(tuán)保護(hù)、分離、縮合、分離、去保護(hù)五大操作單元。2023/10/212從反應(yīng)機(jī)理上講，DNA化學(xué)合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酰胺法、氫磷酸法；具體操作過程又有液相合成和固相合成兩種形式。前者操作繁瑣，基本上已淘汰；后者反應(yīng)中間物的分離程序簡(jiǎn)便，DNA合成儀就是根據(jù)固相亞磷酰胺法原理設(shè)計(jì)的。2023/10/2132023/10/215⑴化學(xué)合成目的基因的前提條件是基因DNA序列已知⑵化學(xué)合成的三種策略①小片段粘接法：根據(jù)目的基因全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈DNA小片段。2023/10/216②補(bǔ)釘延長(zhǎng)法：根據(jù)目的基因兩條互補(bǔ)鏈全序列，分別合成12-15堿基長(zhǎng)的單鏈D