目錄實(shí)驗(yàn)流程2實(shí)驗(yàn)操作31.LB液體培養(yǎng)基的配置3?質(zhì)粒的提取4?瓊脂糖凝膠電泳54.PCR6TOC\o"1-5"\h\z\o"CurrentDocument"5.DNA片段的回收純化 7\o"CurrentDocument"6?目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化 8\o"CurrentDocument"7?菌種保藏 9&雙酶切反應(yīng)..10實(shí)驗(yàn)流程 質(zhì)粒構(gòu)建基因提取——1、2、3PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因一、3DNA片段回收——5、3目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化——6菌種保藏——7重組質(zhì)粒提取——2、3重組質(zhì)粒檢測(cè)：(1)PCR(2)雙酶切——8、5測(cè)序?qū)嶒?yàn)操作1?LB液體培養(yǎng)基的配置【器材】錐形瓶，燒杯，量筒，分析天平，藥匙，高壓蒸汽滅菌鍋.棉花.報(bào)紙?記號(hào)筆，麻繩，紗布等?！驹噭拷湍柑崛∥铮╕eastExtract,胰蛋白陳（Tiyptone,NaCl【實(shí)驗(yàn)步驟】LB液體培養(yǎng)基配方（配置1L培養(yǎng)基）：胰蛋白陳（Tiyptone10g酵母提取物（YeasiExtract5gNaCllOg若配置50ml培養(yǎng)基，按培養(yǎng)基配方比例依次準(zhǔn)確地稱取酵母提取物：0.25g、胰蛋白月東：0.5g、NaCl:0.5g放入燒杯中。蛋白陳很易吸潮，在稱取時(shí)動(dòng)作要迅速。另外，稱藥品時(shí)嚴(yán)防藥品混雜，一把藥匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈、擦干，再稱取另一藥品，瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。2?溶化在上述燒杯中可先加入少于所需要的單蒸水.用藥匙攪勻。待藥品完全溶解后.倒入50ml量筒中，補(bǔ)充水分到501111,倒入錐形瓶中。包扎用棉塞或紗布封住瓶口.再在棉塞外包一層報(bào)紙，用繩子以活結(jié)形式捆扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。滅菌將上述培養(yǎng)基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2）,121.3°C,20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入4。冰箱內(nèi)暫存。滅菌后，將錐形瓶放入烘箱烘干。烘干后，4。保存?！咀ⅰ??燒杯、量筒、錐形瓶應(yīng)先用洗滌精洗干凈.再用單蒸水潤(rùn)洗。滅菌后應(yīng)立即放入烘箱烘干。培養(yǎng)基存放時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。2?質(zhì)粒的提取【器材】加樣槍、滅菌的Tip頭、滅菌的Ep管、離心機(jī)【試劑】滅菌水、TaKaRaMimBESTPlasmidPurificationKitVei.2.0【實(shí)驗(yàn)步驟】第一次使用本試劑盒時(shí).請(qǐng)將RNaseA1混濁液全部加入到Solution【中，均勻混合后4°C保存。實(shí)驗(yàn)操作前請(qǐng)將SolutionIII置于4°C（或冰上）預(yù)冷后使用。大腸桿菌的培養(yǎng)。從平板培養(yǎng)基上挑選單菌落接種至1?4ml的含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。注）培養(yǎng)液不宜過(guò)量，培養(yǎng)液過(guò)量時(shí).會(huì)因菌量太大而溶菌不充分，純化時(shí)會(huì)影響質(zhì)粒的純度。取菌液.12,000ipm離心2分鐘，棄上清。用250卩1的SoliMonI（含RNaseA1）充分懸浮細(xì)菌沉淀。注）注意不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以使用振蕩器（Vonex）等劇烈振蕩使菌體充分懸浮。4?加入250卩1的SolutionII輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5?6次使菌體充分裂解，形成透明溶液。注）此步驟不宜超過(guò)5分鐘。加入400pl的4°C預(yù)冷的SolutionIII,輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5?6次直至形成緊實(shí)凝集塊.然后室溫靜置5分鐘。室溫12,000ipm離心10分鐘，取上清。注）此時(shí)4°C離心不利于沉淀沉降。將試劑盒中的SpinColunm安置于CollectionTube上。&將上述操作6的上清液轉(zhuǎn)移至SpmColunm中，12,000ipm離心1分鐘，棄濾液。將500pl的RinseA加入SpinColunm中,12,000ipm離心30秒鐘,棄濾液。將700卩1的RuiseB加入SpinColumn中,12,000ipm離心30秒鐘，棄濾液。注）請(qǐng)確認(rèn)RinseB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。重復(fù)操作步驟10o將SpinColunm安置于CollectionTube上，12,000ipm離心1分鐘。將SpmColunm安置于新的1.5ml的離心管上，在SpinColunm膜的中央處加入60pl的滅菌蒸徭水或ElutionBuffer,室溫靜置1分鐘。注）把滅菌蒸謂水或ElutionBuffei?加熱至60°C使用時(shí)有利于提高洗脫效率。12,000ipm離心1分鐘洗脫DNA0DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)?！咀ⅰ刻岷玫馁|(zhì)粒需標(biāo)明時(shí)間、名稱等。-20C保存。3?瓊脂糖凝膠電泳【器材】分析天平.錐形瓶，量筒，微波爐，凝膠板?梳子.加樣槍，Tip頭，電泳槽，電泳儀，紫外投射儀【試劑】瓊脂糖（Agarose）,TAE電泳緩沖液.EB,Maikei【實(shí)驗(yàn)步驟】稱取lg瓊脂糖（Agaiose）粉末于錐形瓶中，加入100mlTAEo保鮮膜封口，扎孔。在微波爐中加熱?沸騰兩次，直到看不出油滴，形成均一的溶液。倒入污染區(qū)的錐形瓶中?待冷卻至60°C時(shí)加2ulEB.混勻。4?插入梳子，倒入制膠槽中。室溫靜置20mui.待凝膠全部凝結(jié)后，拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加緩沖液直到?jīng)]過(guò)凝膠為止。按下表加樣：適用于檢測(cè)DNA（小孔）：Markei（DL2000樣品1樣品23ullul（6xbuffer）+3ullul+3ul適用于回收DNA（大孔）：Markei（DL2000樣品15ul17ul（6xbuffer+100ul（質(zhì)粒）電泳15分鐘左右?！咀ⅰ慨?dāng)加入的樣品量小于5i】l時(shí)，6xbuffei均加lulo電泳時(shí)的加樣孔寬度小于6mm時(shí)，每次取5小制品電泳便可得到清晰條帶。如果加樣孔增寬，須適當(dāng)增加Marker制品的加樣量。對(duì)DNA電泳而言.Agarose的純度對(duì)DNA條帶的清晰度影響很大。進(jìn)行Agarose電泳時(shí)，Agarose的濃度與DNA片段的分離性能關(guān)系密切。Agarose濃度越大，對(duì)短片段DNA分離性能越好；反之，Agaiose濃度越小，越有利于長(zhǎng)片段DNA的分離。

5?當(dāng)電泳后片段需回收時(shí)，選用大孔膠，當(dāng)電泳只起檢測(cè)作用時(shí).選用小孔膠。6?若電泳產(chǎn)物需要回收，則需換新的緩沖液。本實(shí)驗(yàn)室有兩種常用Maikei;分別為DL2,000DNAMarker和X-EcoT14IdigestDNAMaikeioAgarose電泳圖像示意圖如下：DL2,000DNAMarkerIdigestDNAMarkerDL2,000DNAMarkerIdigestDNAMarker2,000bp1,000bp750bp500bp250bp100bp19,329bp—925bp2,000bp1,000bp750bp500bp250bp100bp19,329bp—925bp 421bp4.PCR【器材】加樣槍、滅菌PCR管、滅菌Tip頭、PCR擴(kuò)增儀、冰袋【試劑】DNA模板、引物、滅菌水、buffer.dNTP(mixsTaq酶【操作步驟】加樣前應(yīng)先打開(kāi)PCR儀，預(yù)熱。1.在0.51111PCR管中加入下列試劑：50ul體系：滅菌水:38ul1Oxbuffer(LA):5uldNTP:4ul質(zhì)粒:0.5ulF:lulR:lulLA（冰上）：0.5ul總體積50.011120ul體系:滅菌水:13.35ullOxbuffei（EX:2uldNTP（Mix:2ul質(zhì)粒:0.5ulPl:lulP2:lulEX（冰上）:0.15ul總體積20.0111將上述PCR反應(yīng)混合物混勻放入PCR儀中。設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增：TOC\o"1-5"\h\z94°C 5min94°C 30s55°C（退火溫度不固定，根據(jù)引物進(jìn)行調(diào)整） hum72°C 30s（延伸時(shí)間根據(jù)目的片段的長(zhǎng)度進(jìn)行調(diào)整）72°C 7min共30個(gè)循環(huán)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。【注】當(dāng)PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物目的片段還需進(jìn)行后續(xù)操作時(shí)，選用LATaq酶；當(dāng)PCR反應(yīng)用于檢測(cè)時(shí)選用EXTaq酶.buffer的選擇應(yīng)與酶的選擇相對(duì)應(yīng)。例如：LATaq酶對(duì)應(yīng)的buffer為lOxLAPCRBuffer.在PCR小管中加樣時(shí)，應(yīng)先將各試劑加到管壁上，最后混勻。這樣既節(jié)省時(shí)間，又節(jié)省槍頭。5.DNA片段的回收純化【器材】加樣槍、滅菌的Tip頭、滅菌的Ep管、水浴鍋、離心機(jī)【試劑】TaKaRaAgaroseGelDNAPunficationKitVei.2.0s滅菌水【操作步驟】實(shí)驗(yàn)前將水浴鍋調(diào)到75度；將滅菌水放入烘箱中加熱；空管去皮。使用TAE緩沖液制作瓊脂糖凝膠，然后對(duì)目的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。此時(shí)應(yīng)注意盡量切除不含目的DNA部分的凝膠，盡量減小凝膠體積，提高DNA回收率。注）切膠時(shí)請(qǐng)注意不要將DNA長(zhǎng)時(shí)間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。先切后驗(yàn)證。4?切碎膠塊。膠塊切碎后可以加快操作步驟6的膠塊融化時(shí)間，提高DNA的回收率。稱量膠塊重量?計(jì)算膠塊體積。計(jì)算膠塊體積時(shí).以1mg=lpl進(jìn)行計(jì)算。6?向膠塊中加入膠塊融化液DR-IBuffer,DR-IBuffer的加量如下表：凝膠濃度DR-IBuffer使用量1.0%3個(gè)凝膠體積量7?均勻混合后75°C加熱融化膠塊（低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠只需在45°C加熱）。此時(shí)應(yīng)間斷振蕩混合，使膠塊充分融化（約6~10分鐘）。注）膠塊一定要充分融化，否則將會(huì)嚴(yán)重影響DNA的回收率。&向上述膠塊融化液中加入DR-IBuffei?量的1/2體積量的DR-IIBuffer,均勻混合。當(dāng)分離小于400bp的DNA片段時(shí)，應(yīng)在此溶液中再加入終濃度為20%的異丙醇。將試劑盒中的SpinColunm安置于CollectionTube上。將上述操作7的溶液轉(zhuǎn)移至SpinColunm中，12,000ipm離心1分鐘，棄濾液。注）如將濾液再加入SpinColunm中離心一次，可以提高DNA的回收率。將500卩1的RuiseA加入SpinColunin中.12,000fpm離心30秒鐘，棄濾液。將700卩1的RuiseB加入SpinColunm中，12,000rpm離心30秒鐘，棄濾液。注）請(qǐng)確認(rèn)RinseB中已經(jīng)加入了指定體積的100%乙醇。重復(fù)操作步驟llo將SpinColunm安置于CollectionTube上，12,000lpm離心1分鐘。將SpinColunm安置于新的1.5ml的離心管上，在SpmColunm膜的中央處加入12.5卩1的滅菌蒸憎水或ElutionBuffer,室溫靜置1分鐘。重復(fù)操作步驟150注）把滅菌蒸鐳水或ElutionBuffer加熱至60°C使用時(shí)有利于提高洗脫效率。12,000rpm離心1分鐘洗脫DNA。6?目的片段與載體連接及轉(zhuǎn)化【器材】超凈臺(tái)：酒精燈、打火機(jī)、加樣槍、滅菌PCR管、滅菌Tip頭、搖床、冰袋、水浴鍋【試劑】PMD-18載體、目的片段、SolutionI、感受態(tài)細(xì)胞、LB培養(yǎng)基（加Amp、含AMP的瓊脂培養(yǎng)基【實(shí)驗(yàn)步驟】實(shí)驗(yàn)前水浴準(zhǔn)備。2?在PCR管中加入：PMD-18載體：lul目的片段:4ul總體積5i】l再加入5ulSolutionI16°C,連接90nuii全量10ul加入至感受態(tài)細(xì)胞中?冰上放置30niui.42°C,熱激45s.冰上，lniin.加890U1LB培養(yǎng)基（不加Amp,37°C搖床培養(yǎng)60mm。9?涂布在含AMP的瓊脂培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)。（3ml培養(yǎng)基中加入3ulAMP）10.第二天晚上五點(diǎn)挑菌，在3nilLB培養(yǎng)基（加Amp中培養(yǎng),37°C過(guò)夜。7?菌種保藏【器材】超凈臺(tái)：酒精燈、打火機(jī)、1ml加樣槍、滅菌Tip頭【試劑】50%的甘油【實(shí)驗(yàn)步驟】1?實(shí)驗(yàn)前超凈臺(tái)滅菌。將500U150%的甘油與500ul菌液混合，-80°C保存。8?雙酶切反應(yīng)【器材】水浴鍋、滅菌Tip頭、0.5mlPCR管、加樣槍【試劑】Buffer.限制酶1、限制酶2、重組質(zhì)粒、滅菌水【實(shí)驗(yàn)步驟】、實(shí)驗(yàn)前水浴準(zhǔn)備。在0.51111PCR管中加入下列試劑