“創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金“創(chuàng)新化學(xué)實(shí)驗(yàn)與研究基金”論文#固體發(fā)酵培養(yǎng)南海紅樹林內(nèi)生真菌次3級#代謝產(chǎn)物研究蔡奕彪蔡小玲（中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院海洋天然產(chǎn)物有機(jī)研究所；廣東省生物功能分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510275）摘要：海洋紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多，是天然藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。本文對南海紅樹林內(nèi)生真菌140進(jìn)3行#了固體發(fā)酵培養(yǎng)，得到醌類等類型的化合物。關(guān)鍵詞：紅樹林內(nèi)生真菌；次級代謝產(chǎn)物；固體培養(yǎng)海洋多變復(fù)雜的環(huán)境導(dǎo)致了海洋微生物的多樣性。海洋微生物因其特殊的生存環(huán)境而具有產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的巨大潛力。近年來，從海洋真菌中分離鑒定了許多結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物，這些化合物顯示了良好的抗腫瘤、抗細(xì)菌或抗真菌等生物活性，為新藥的開發(fā)和各種疑難疾病的治愈提供了新的希望［1］。紅樹林是一種熱帶鹽灘上特有的植物群落，因此組成這個群落的幾種主要種類在形態(tài)、生理、生態(tài)的各個方面都有它的特殊性：主要表現(xiàn)在胎萌現(xiàn)象以及根系的多樣性中，以及紅樹林區(qū)經(jīng)常受到海水的浸淹，土壤中的含鹽量很高（一般在4.6?27.8%。之間），因而紅樹植物絕大部分屬于鹽生植物，具有排除或分泌鹽分的結(jié)構(gòu)，能將吸入體內(nèi)的鹽分分別經(jīng)過莖、葉表面分布的鹽腺排出，排在莖、葉表面的鹽分晶體被雨水等淋洗掉。如桐花樹、海欖雌等植物，就有泌鹽的機(jī)能，能排除過量的鹽分，以適應(yīng)高鹽度的基質(zhì)［2-3］。在固體發(fā)酵中，菌體可以更高效地利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時，可能是因?yàn)楣腆w發(fā)酵更好的模擬了其生活環(huán)境，且當(dāng)菌株附著與固體基質(zhì)上生長時，供氧豐富，生長密度大，生存競爭更為激烈，因此產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物的量也會提高。固體發(fā)酵還有含水量少，廢水、廢渣少，環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)［4］。醌類化合物（quinonoids）指分子中具有不飽和環(huán)二酮結(jié)構(gòu)（醌式結(jié)構(gòu)）或容易轉(zhuǎn)變?yōu)檫@種醌式結(jié)構(gòu)的天然有機(jī)化合物。主要包括:苯醌、萘醌、菲醌、蒽醌四類。它是一種色素，在植物中主要存在于蓼科大黃、何首烏、虎杖；茜草科茜草、豆科決明子、番瀉葉、百合科蘆薈、唇形科丹參、紫草科的紫草等。近年來，隨著人們對海洋微生物次級代謝產(chǎn)物研究的深入，一些海洋來源的、結(jié)構(gòu)新穎的且具有良好生物活性的的醌類化合物相繼被發(fā)現(xiàn)，它們所表現(xiàn)出來的抑菌、抗氧化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面的生物活性比陸生來源的往往要好很多［5］。1實(shí)驗(yàn)部分1.實(shí)1驗(yàn)試劑和儀器（1）培養(yǎng)、分離、確定化合物結(jié)構(gòu)所用的葡萄糖為化學(xué)純，蛋白胨（BR）,酵母膏（BR）,粗海鹽（微生物養(yǎng)殖用），瓊脂（BR），其它實(shí)驗(yàn)用試劑均為市售（AR）試劑。薄層層析是用青島海洋化工廠生產(chǎn)的硅膠GF254，柱層析硅為青島海洋化工廠生產(chǎn)的200-300目硅膠，SephadexLH-20葡聚糖凝膠。（2）核磁共振譜用VarianINOVA500NB，BRUKER400NB與300NB核磁儀測定（iHNMR譜500MHz,i3CNMR譜125MHz，TMS內(nèi)標(biāo)）；HREIMS用VGAutospec-500質(zhì)譜儀；紅外光譜用EQUINOX55-A590/3F（Bruker）紅外儀測定；紫外光譜用日本島津公司的UV-2501PC紫外和可見吸收光譜測定；元素分析用德國Elementar公司的VarioELCHNS-O元素分析儀；熔點(diǎn)用北京X4型顯微熔點(diǎn)儀測定（未校正）。Agilent1100型高效液相色譜儀；Waters515HPLC泵；Waters2487雙波長檢測器；浙江大學(xué)N-2000雙通道色譜工作站。1.菌2種和菌種的固體培養(yǎng)內(nèi)生真菌1403#為鹽生堅座殼種（Haloroselliniasp.）真菌，來自香港紅樹林樹葉內(nèi)部，由香港城市大學(xué)L.L.P.Vrijmoed教授等分離得到，菌種保存在香港城市大學(xué)、中山大學(xué)和武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心內(nèi)。我們課題組的姜廣策、黃華容、夏雪奎三位博士曾對其進(jìn)行大量液體培養(yǎng)，并對其活性次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行過深入的研究，分出大量的活性強(qiáng)的化合物。本次采用了固體營養(yǎng)基，對1403#內(nèi)生真菌進(jìn)行固體發(fā)酵，使用PDA固體培養(yǎng)基（10g蛋白胨、5g酵母膏、10gNaCl、1.5%的瓊脂，力口dH2O溶解后，調(diào)pH至7.4，dH?O定容至1L，115℃，20min高壓滅菌），接種于平板上的固體培養(yǎng)基中，在溫度設(shè)置在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25天。1.提3取和分離近4升的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)30天后，將固體培養(yǎng)基切碎，并用甲醇（MO）浸泡一周后，用紗布過濾，分離固體培養(yǎng)基和菌液，此過程重復(fù)3次，培養(yǎng)基曬干，菌液濃縮，再用乙酸乙酯（EA）萃取，EA提取物用適量的200-300目硅膠拌樣，上柱粗分。分別用5%，10%，20%，30%，50%，80%，100%的EA\PE（石油醚）淋洗，收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶純化。固體培養(yǎng)基曬干后，用MO反復(fù)浸泡。提取物濃縮后合并，再拌硅膠過大柱，以EA\PE梯度淋洗。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶純化。2結(jié)果和分析此次固體培養(yǎng)1403#內(nèi)生真菌，經(jīng)過分離純化得到5個化合物，尚未得到新化合物，目前分離

仍在進(jìn)行中，下面是所分離得到的化合物?；衔?：灰黃霉素，為錐狀晶體。易溶于氯仿，薄層層析顯示，紫外有強(qiáng)熒光吸收。FABMS中得到分子離子峰m/z353[M+1]+，而且在EI-MS譜圖中發(fā)現(xiàn)[M]+：[M+2]+為3：1，這表明分子中含有1個氯原子。結(jié)合核磁共振氫譜和碳譜，可推出分子式為C17H1706cl，不飽和度為9,顯示分子可能含有芳香環(huán)?；衔?：灰黃霉素 化合物2：去氯灰黃霉素1HNMR(CDCl3,TMS)中顯示含有17個氫信號，SH6.52(1H,s)，SH5.53(1H,s)，SH4.09(3H,s)，SH3.98(3H,s)，SH3.68(3H,s),SH2.83(1H,dd)，2.38(1H,m)，2.33(1H,dd)，0.96(3H,d)；推出分子中含有3個連氧的甲基，還有一個和CH相連的甲基。13CNMR和DEPT譜中，表明分子含有2個羰基季碳SC196.9和5"92.4,3個連氧的烯季碳SC170.7,SC157.7,S364.6以及3個甲氧基SC57.0，SC56.6，56.3和1個甲基SC14.2，一個亞甲基和2個次甲基。結(jié)合以上分析，此化合物應(yīng)還有2個環(huán)；根據(jù)前人的工作和經(jīng)驗(yàn)，推測可能為灰黃霉素，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖數(shù)據(jù)對照[6]，確定化合物為灰黃霉素?；衔?：去氯灰黃霉素，為白色晶體，mp182-185℃，極性和灰黃霉素相似。從FABMS譜得到其分子離子峰m/z319[M+1]+；1HNMR譜中顯示該化合物可能含有一個連著CH的甲基5口H0.90(3H，d，7.0)，另外有3個連氧的甲基Sh3.67(3H，s)，3.89(3H，s)，3.95(3H，s)，以及6個H信號6.34(1H,d，1.5)，6.20(1H，d，1.5)，5.50(1H，s)，2.85(1H，dd，3.0，16.0)，2.74(1H，m)，2.29(1H，dd，4.0，16.0)，從它們的偶合常數(shù)分析，SH6.34和6.20可能為苯上間位的兩個氫，SH2.85和2.29這2個氫可能為同碳上的氫。13CNMR和DEPT譜圖分析，化合物含有8個季碳，其中可能包括2個羰基季碳SC196.1和192.0，其他為SC176.9，172.0，171.3，105.1和90.4,另外從碳譜中也進(jìn)一步確定分子中含有3個甲氧基SC57.0，56.7,56.4和1個甲基SC14.5,同時也確定分子中Sh2.85和2.29是Sc40.7的兩個氫；分析DEPT-90的碳譜，分子中還有4個次甲基，SC105.1,93.9和89.6為烯烴的CH,而5?37.2對應(yīng)的SH2.74,說明它應(yīng)與甲基Sc14.5相連。1H-1HCOSY中，Sh6.34和6.20弱的相關(guān)關(guān)系，確證它們?yōu)殚g位的苯氫，SH2.85和2.29的強(qiáng)相關(guān)關(guān)系再次肯定它們?yōu)镾C40.7這個亞甲基的兩個氫。同時，也可得到SH0.90和2.74相關(guān)。去氯灰黃霉素的結(jié)構(gòu)中存在2個手性碳原子，這樣化合物就存在幾種可能的構(gòu)型。查閱文獻(xiàn)[7]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)去氯灰黃霉素的2個手性碳原子的構(gòu)型不同時，它們所對應(yīng)的熔點(diǎn)也不同，絕對構(gòu)型為(4S,5R)的熔點(diǎn)181-182℃,構(gòu)型為(4S,5S)時，熔點(diǎn)為129-131℃,對照熔點(diǎn)，推測該化合物與Cole報道的(4S,5R)去氯灰黃霉素一致⑻。去氯灰黃霉素與灰黃霉素的差別在于10-C上的氯原子，但抗真菌活性卻比灰黃霉素弱很多，因此，去氯灰黃霉素是發(fā)酵得灰黃霉素的主要雜質(zhì)，在發(fā)酵生產(chǎn)中采用在發(fā)酵培養(yǎng)基中同時加入一定量的NaCl和KCl來提高Cl，降低去氯灰黃霉素的產(chǎn)生量，提高灰黃霉素的產(chǎn)量和質(zhì)量［9］?；衔?：1,4-二羥基-7-甲基-9,10-蒽醌，是粉紅色粉末。Mp:166-167℃。ESI-MS中的分子離子峰［M-H］+為253。其氫譜中低場區(qū)有2個活潑氫的信號分別為312.11,12.00ppm,表明該羥基有可能與位羰基形成氫鍵，在芳香質(zhì)子信號區(qū)有5個質(zhì)子信號37.83(dd,0.9,7.5,1H)，7.65(m,2H)，7.29(dd,1.2,8.4,1H)，7.10(s,1H)，可以看出該化合物有一個鄰二取代的苯環(huán)和一個五取代苯環(huán)存在，并且高場區(qū)僅有一個連苯環(huán)的甲基存在。其碳譜中顯示出15個碳，其中有五個CH，一個CH3這與其一維氫譜是一致的，還有九個季碳，其中3192.37，181.81ppm的季碳可能是兩個與苯環(huán)共軛的羰基，這表明3有可能是一個蒽醌類化合物。還有3162.59,162.30ppm的季碳表明其中苯環(huán)上有兩個連有羥基的碳存在。其它的季碳均在均在芳香區(qū)更加確定了3是一個蒽醌類化合物。最后化合物確定為1,4-二羥基-7-甲基-9,10-蒽醌。該化合物是首次從海洋真菌中分離得到的?；衔?：化合物1-hydroxy-3-methylanthracene-9,10-dione(3-8)，是黃色粉末。極性較小，PE為流動相，通過制備薄層層析純化得到純品。Mp:118-119℃。ESI-MS中的分子離子峰［M-H］-為237。通過1HNMR圖譜，可以看到有一個螯合的活潑氫12.57(s,OH),一個連在苯環(huán)上的甲基8(s)，兩個間位的苯環(huán)上的氫7.60(d,2.5Hz),7.11(d2.5Hz)，以及一個1，2-取代苯環(huán)8.30(2H,d,8.4,2.5Hz),7.81(2H,ddd,8.4,5.7,2.5),7.60(d,2.5Hz),最后，推斷該化合物為1-hydroxy-3-methylanthracene-9,10-dione，與文獻(xiàn)報道一致［10］?；衔?：大黃酚，為黃色針狀晶體，熔點(diǎn)為196-197℃。ESI-MS顯示分子離子峰為m/z255［M+1］+，結(jié)合氫譜、碳譜推出化合物的分子式為C15Hl0O4,計算出其不飽和度為11,說明分子結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)。1HNMR（CD3COCD3,TMS）中有8組氫信號，位于低場處有兩個活潑氫信號，SH12.01（1H,s）和SH11.92（1H,s）。說明這兩個羥基氫應(yīng)與羰基鄰近，形成分子內(nèi)氫鍵。SH7.81（1H,dd），SH7.78（1H,dd）和SH7,34（1H,t）為苯環(huán)上相連的三個氫，SH7.60（1H,s）和SH7,18（1H,s）為苯上的間位氫，SH2.50（3H,s）為連在苯環(huán)上的甲基氫。13CNMR和DEPT譜中，表明分子中含有9個季碳，其中兩個為羰基碳SC189.28和SC181.72，而bc163.98和SC160.76為苯環(huán)上與羥基相連的碳信號，SC21.44為與苯環(huán)相連的甲基碳信號，結(jié)合氫譜碳譜并與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照推出該化合物的結(jié)構(gòu)[11]。3結(jié)果與討論由于海洋環(huán)境具有低溫、高壓、高鹽、少光照、貧營養(yǎng)等特點(diǎn)，所以海洋微生物有著自己獨(dú)特的代謝方式，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的代謝產(chǎn)物[12]。本文是對對南海紅樹林內(nèi)生真菌1403#進(jìn)行了固體培養(yǎng)，得到一系列的醌類類化合物。由于只培養(yǎng)量較少（4升），相對于液體培養(yǎng)，產(chǎn)量還是較豐富，但尚未得到新化合物，目前分離仍在進(jìn)行中。鑒于固體發(fā)酵對產(chǎn)量有極大的影響，下一步的工作還有就是更換種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)基，對真菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并對固液發(fā)酵的影響因素進(jìn)行探討，以得到更豐富的代謝產(chǎn)物。參考文獻(xiàn)[1]鄧祖軍.紅樹林內(nèi)生真菌生物多樣性及其代謝產(chǎn)物生物活性的研究[M].廣州中山大學(xué)碩士論文,2005:22-23.cao,L.X.，You，J.L.，Zhou，S.N.EndophyticfungifromMusaacuminateleavesandrootsinSouthchina.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2002,18:169-171.[3]吳少杰，李富超，秦松.膠州灣海洋放線菌的分布及其抗微生物活性[J].中國海洋藥物雜志,2006,25（5）,11.廖春燕,鄭裕國1微生物學(xué)通報,2005,32（1）:991031譚倪，邵長倫，佘志剛，林永成，海洋微生物次級代謝產(chǎn)物中醌類化合物的研究進(jìn)展.中國天然藥物，2009，7（1）：71-80.[6]姜廣策，林永成，周世寧等.中國南海紅樹林內(nèi)生真菌No.1403次級代謝物的研究.中山大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2000，39（6）：68-72.JarvisBB,ZhouY,JiangJ,WangS.ToxigenicMoldsinWater-DamagedBuildings:Dechlorogriseofulvinsfro