歐陽術(shù)創(chuàng)編 歐陽術(shù)創(chuàng)編 2021.02.02 歐陽美創(chuàng)編 2021.02.02歐陽術(shù)創(chuàng)編 歐陽術(shù)創(chuàng)編 2021.02.02 歐陽美創(chuàng)編 2021.02.021.冰凍切片是免疫組級化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。其最突岀的優(yōu)點是能舉較完好地保存多種抗原優(yōu)點是能舉較完好地保存多種抗原的免疫活性，尤其是細(xì)胞表面抗原更應(yīng)采用冰凍切片。新鮮的組織及已固定的組級均可作冰凍切片。創(chuàng)作：歐陽術(shù)時間：2021.02.02創(chuàng)作：歐陽術(shù)冰凍時，組級中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位。一般認(rèn)為冰晶少而大時，影響較小，冰晶小而多時，對組級結(jié)構(gòu)損害較大，在含水量較多的組級中上述現(xiàn)象更易發(fā)生。冰晶的大小與其生長速率成正比，而與成核率(形成速率)成反比，即冰晶形成的數(shù)量愈多則愈小，對組級結(jié)構(gòu)影響愈嚴(yán)重。因此，應(yīng)盡量降低冰晶的數(shù)量OFish認(rèn)為冰凍開始時，冰晶成核率較慢，以后逐1增加，其臨界溫度為?33。C,從?30。C降至?43。C之間,成核率急劇增M達(dá)1018,然后再減慢?；谏鲜隼碚摽刹扇∫韵麓胧┬瞪俦У男纬伞?1)速凍，便組級溫度驟降,縮短從?33。C43OC的時間,毓少冰晶的形成。其方法有二：干冰?丙酮（酒精）法：將150-200ml丙酮（酒精）裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至他和呈粘稠狀，再加干冰不再昌泡時，溫度可ii-70°CC,用一小燒杯（50-100ml）內(nèi)裝異戍烷約50ml,再將燒杯緩慢置人干冰丙酮（純酒精）飽和液內(nèi),至異戊烷溫度fi-70°C時即可使用。將組織（大小為lcmx0.8cmx0.5cm）投人異戍烷內(nèi)速凍30-60S后取出，或置恒冷箱內(nèi)以備切片，或置-80°C溫冰箱內(nèi)貯存。液氮法：將組級塊平放于軟塑冊蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）,如組級塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組級，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi),當(dāng)盒底部接觸液氮時即開始?xì)饣痱v，此時小盒保持原位切勿浸人液氮中，大約10-20S組級即迅速冰結(jié)成挾。取出組織冰塊立即置入?8（rc冰箱貯存?zhèn)溆?或置入恒冷箱切片機(jī)冰凍切片。（2）將組級置于20%?30%蔗糖溶液1~3天，利用高滲吸收組級中水分，減少組級含水量。敷咆冰凍切片的因素較多，因此，技術(shù)難度較大，選擇好的冰凍切片機(jī)是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵。目前冰凍切片機(jī)有兩類：①恒慢冰凍切片機(jī)（Cryastat）：為較理想的冰凍切片機(jī),型號很多，但其基本結(jié)構(gòu)是將切片機(jī)置于?30°CC低溫密閑室內(nèi)，故切片時不受外界溫度和環(huán)境敷響，可連續(xù)切薄片至2?4沖,完全能滿足免疫組級化學(xué)標(biāo)記要求。切片WJft溫室內(nèi)溫度以?15°C~18￡為宜，溫度過低組級易破碎，抗卷檢的位置及角度要適當(dāng)，載玻片附貼組級切片，切勿上下移動。②開放式冰凍切片機(jī)：包括半導(dǎo)體致冷切片機(jī)和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷凍切片機(jī)。切片時暴靄空氣中,溫度不易控制，切片技術(shù)難度大，在高溫季節(jié)，切片更加困難,且切片厚8~15ym,不易連續(xù)切片，但其優(yōu)點是價廉，國內(nèi)有生產(chǎn)。冰凍切片后如不染色，必須吹干,貯存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后貯存冰箱保存。2.石蠟切片其優(yōu)點是組級結(jié)構(gòu)保存良好，在病理fDlIli性研究中有較大的實用價值，能切連續(xù)薄片，組級結(jié)構(gòu)淸晰，抗原定位準(zhǔn)確。用于免疫組化技術(shù)的石賭切片制備與常規(guī)制片略有不同：①腕水、透明等過程應(yīng)在4C。C下進(jìn)行，以盡量械少組級抗原的損失。②組級塊大小應(yīng)限于2cmxl.5cmx0.2cm,使組級充分骯水、遹明、浸蠟。③浸蠟、aaii程中，石賭應(yīng)保持在60C以下，以溶點低的軟蠟最好（即低溫石艄包埋）。組級挾骯水、透明、浸蠟時間參考表1-3:表1-3組織塊處理時間表70%乙醇4°C3~4h80%乙醇4°C3~4h90%乙醇4°C2~3h95%乙醇I4°C2~3h95%乙醇II4°C1~2h100%乙醇I4°C1.5h100%乙醇II4°C1.5h二甲苯I4°C0.5~lh二甲苯II4°C0.51~lh石蠟I60°Clh石賭II60°C2h以上全過程為18-24h,也可在室溫內(nèi)使用自動腕水機(jī)代替。如組級塊小，直徑小干0.5cm,可用快速石蠟包理切片，全過程只需4h左右。石臘切片為常規(guī)制片技術(shù)，切片機(jī)多為輪轉(zhuǎn)式，切片厚度2~7呻,應(yīng)用范圍廣，不影響抗體的穿透性,染色均勻一致。由于甲能固定、有機(jī)熔劑和包埋劑對組抗原有一定的損害及逆蔽，使抗原特征發(fā)生改變。有人報告經(jīng)蛋白80消化，可以改善光鏡免疫組化染色強度，常用的有胰蛋白陽、錐霉蛋白萌及胃蛋白酶等消化法。石艄切片應(yīng)人37C恒溫箱過夜，這樣烤片可減少染色中腕片現(xiàn)象。切片如需長期貯存，可存放于4C冰箱內(nèi)備用。石臘切片優(yōu)點較多，但在制片過程中要經(jīng)過酒精、二甲苯等有機(jī)溶劑處理，組級內(nèi)抗原活性失去較多，有人采用冷凍干煤包埋法(Freezedryingembeddingmethed),可以保存組縱內(nèi)可溶性物廈，肪止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。該法是將新鮮組級低溫速凍,利用冷凍干