A重組蛋白分離純化方法選擇的基因原則10外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化針對不同的產(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用合適分離純化介質(zhì)的選擇分離純化過程的規(guī)?；槍Σ煌漠a(chǎn)物表達(dá)形式采取不同的策略采用分泌型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，通常體積大、濃度低，因此應(yīng)在純化之前采用沉淀或超濾等方法先進(jìn)行濃縮處理；采用包涵體型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，應(yīng)先離心回收包涵體；采用融合型戰(zhàn)略表達(dá)重組蛋白，一般是胞內(nèi)可溶性的，擬首先選用親和層析進(jìn)行純化

表達(dá)在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的間隙中的蛋白質(zhì)，應(yīng)用低濃度的溶菌酶處理，然后再用滲透壓休克法釋放重組蛋白。針對不同性質(zhì)的重組蛋白選擇不同的層析類型

等電點(diǎn)處于極端區(qū)域（pI≤5

或pI≥8）的重組蛋白應(yīng)首選離子交換法進(jìn)行分離，這樣很容易除去幾乎所有的雜蛋白；重組蛋白特異性的配體、底物、抗體、糖鏈等都是首選親合層析純化方法的重要條件，原則是它們與目標(biāo)蛋白之間的解離常數(shù)應(yīng)在合適的范圍內(nèi)（10-8-10-4

mol/L）；

疏水層析和反相層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性差異進(jìn)行分離的；

凝膠過濾層析是根據(jù)蛋白的分子量和體積差異進(jìn)行分離的；

徑向?qū)游鍪墙陙戆l(fā)展起來的集層析分離和膜分離于一體的一種復(fù)合技術(shù)，在流量、負(fù)荷量等參數(shù)方面顯示出極大的優(yōu)越性。多種分離純化技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用在進(jìn)行重組蛋白的純化時，通常需要綜合使用多種技術(shù)，一般來說，在選擇分離純化方法時應(yīng)遵循下列原則：應(yīng)選擇不同分離純化機(jī)理的方法聯(lián)合使用應(yīng)首先選擇能除去含量最多雜質(zhì)的方法應(yīng)盡量選擇高效的分離方法應(yīng)將最費(fèi)時、成本最高的分離純化方法安排在最后階段合適分離純化介質(zhì)的選擇常用的蛋白質(zhì)分離純化介質(zhì)有Sephadex和Seperose。理想的分離純化介質(zhì)應(yīng)具有下列性質(zhì)：對目標(biāo)蛋白具有較高的分離效率對目標(biāo)蛋白不會造成變性化學(xué)性能和機(jī)械性能穩(wěn)定，重復(fù)性好價格低廉分離純化過程的規(guī)?；鞍踪|(zhì)分離純化的實(shí)驗(yàn)室工藝、技術(shù)、方法在大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化過程未必合適，如：實(shí)驗(yàn)室方法在工程上可能難以實(shí)現(xiàn)（超聲波破細(xì)胞壁）實(shí)驗(yàn)室方法在大規(guī)模生產(chǎn)中可能成本過高（超速離心）因此，在很多情況下，實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)路線不等于生產(chǎn)工藝。B離子交換層析10外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換層析的基本操作離子交換介質(zhì)的選擇原則離子交換層析的基本原理離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以特定的含離子溶液為流動相，利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù)。離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等；

離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中的其它陽離子交換劑的基本性能離子或陰離子起交換作用如果有兩種以上的成分被吸附在離子交換劑上，則在用洗脫液洗脫時，各成分被洗脫的可能性取決于各自反應(yīng)的平衡常數(shù)吸附在離子交換劑上的蛋白質(zhì)可通過改變pH使吸附的蛋白質(zhì)失去電荷而解離下來不同蛋白質(zhì)與離子交換劑之間形成離子鍵數(shù)目不同，即親和力大小有差異，因此只要選擇適當(dāng)?shù)南疵摋l件便可將混合物中的成分逐個洗脫下來，達(dá)到分離純化的目的離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)

陰離子交換劑：強(qiáng)堿型和弱堿型可電離的基團(tuán) 磺酸基（-SO3H）離子交換劑的分類 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羥基（-OH）

陽離子交換劑：強(qiáng)酸型和弱酸型可電離的基團(tuán) 伯胺基（-NH2） 仲胺基（-NHCH3

） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3)3

）離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換劑的分類強(qiáng)離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽離子交換劑在pH值降低時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換樹脂：最常見的離子交換樹脂是含有酸性或堿性基團(tuán)的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物離子交換樹脂的優(yōu)點(diǎn)是：流速快，對小分子物質(zhì)的交換容量大，因而適合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物質(zhì)的分離純化離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換纖維素：

離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過，因而對生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大

陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等維素）

陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換葡聚糖：離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物（SephadexG）Sephadex的優(yōu)點(diǎn)如下：親水性強(qiáng)、不會引起生物分子的變性和失活，母鏈對蛋白質(zhì)、核酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小電離基團(tuán)在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng)因而Sephadex是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì)離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換葡聚糖：

常用的離子交換葡聚糖包括：陽離子交換劑

CM-SephadexC-25，CM-SephadexC-50

SephadexC-25，SephadexC-50陰離子交換劑 DEAE-SephadexA-25，DEAE-SephadexA-50

QAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-50

離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖：

離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團(tuán)的SepharoseCL-6B

DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽離子型）尤其是介質(zhì)受pH和離子強(qiáng)度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)此具有穩(wěn)定的外形體積離子交換介質(zhì)的選擇原則一般而言：酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化堿性物質(zhì)用陽離子交換劑分離曲線來選擇離子交換介質(zhì)的選擇原則12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）對pI=5的某酸性蛋白質(zhì)在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時，應(yīng)首選DEAE纖維素；在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時，應(yīng)首選CM纖維素離子交換層析的基本操作層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的2倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要離子交換層析的基本操作樣品進(jìn)柱為了達(dá)到滿意的分離效果，進(jìn)樣量一般為介質(zhì)交換容量的10-20%為了避免進(jìn)樣溶液中的離子強(qiáng)度過高，樣品濃度不宜太高交換容量：離子交換劑中全部可交換的離子或功能基團(tuán)的總數(shù)離子交換層析的基本操作樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫102030405060708090分子濃度離子強(qiáng)度pH值C凝膠層析10外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化凝膠層析的基本原理凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)凝膠層析的基本操作凝膠介質(zhì)的選用原則凝膠層析的基本原理凝膠層析是利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠作為固定相，對混合物中各組份按分子大小進(jìn)行分離的層析技術(shù)，又稱為分子篩分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大的，會被全部排阻在凝膠顆粒之外，即全排阻；兩種全排阻的分子即使大小不同，也不能分開；它們下行速度快分子直徑比凝膠最小孔隙直徑小的，能進(jìn)入凝膠顆粒的全部孔隙即使大小不同也不能分開；它們的下行速度慢鑒于上述原理，凝膠層析可用于重組蛋白溶液脫鹽、分子量測定以及分離純化。凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)葡聚糖凝膠的種類有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝膠的吸水量為5.0毫升

葡聚糖凝膠對堿比較穩(wěn)定，在酸性環(huán)境中其糖苷鍵易水解濕態(tài)的葡聚糖可加熱到110℃，干的則能耐受120℃高溫葡聚糖凝膠（Sephadex）

SephadexLH是羥丙基化的Sephadex，這類層析介質(zhì)的流動相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機(jī)溶劑，因此適用于非水溶性溶

質(zhì)的凝膠過濾

凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)

瓊脂糖凝膠是由瓊脂中分離出來的天然凝膠，常見的有Sepharose（Sepharose2B、4B、6B，數(shù)字代表干膠的百分比）和Bio-Gel-A等（Bio-Gel-A0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，數(shù)字X106代表排阻限度。瓊脂糖凝膠

當(dāng)溫度高于50℃時瓊脂糖凝膠便融化，只能在較低的溫度下使用。瓊脂糖凝膠是一種大孔凝膠，因而適合于分離分子量較大的生物大分子物質(zhì)（如蛋白質(zhì)和DNA）。

SepharoseCL是二溴丙醇交聯(lián)的瓊脂糖，其孔徑大小和分離范圍與普通瓊脂糖一樣，但熱和化學(xué)穩(wěn)定性增加，能高溫消毒。凝膠介質(zhì)的基本性質(zhì)

聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺為單位由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成的人工合成凝膠，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯(lián)劑越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝膠的商品名為Bio-Gel，型號從P-2至P-300共10種聚丙烯酰胺凝膠（數(shù)字X1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度）凝膠介質(zhì)的選用原則將樣品中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分開，稱為組別分離，其分離策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。

組別分離一般選用SephadexG-25或G-50，對于小肽和低分子量的物質(zhì)（分子量范圍1000-5000）的脫鹽可選用SephadexG-10、G-組別分離15、Bio-GelP-2或P-4凝膠介質(zhì)的選用原則將樣品中一些分子量比較接近的物質(zhì)分開，這種分離叫分級分離該策略是使高分子物質(zhì)完全被排阻，小分子物質(zhì)完全滲入凝膠內(nèi)。

分級分離一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質(zhì)的凝膠在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內(nèi)部，但由分級分離于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。凝膠層析的基本操作平衡溶液的流速應(yīng)低于層析時需要的流速注意凝膠的斷層和氣泡層析柱平衡操作壓控制平衡和洗脫時應(yīng)維持流速恒定恒定的操作壓是恒流的先決條件凝膠層析的基本操作上柱樣品溶液的體積根據(jù)分離要求來確定：進(jìn)樣體積進(jìn)行組別分離時，樣品溶液最大可為柱體積的10%進(jìn)行分級分離時，樣品溶液的體積要小，使樣品層盡可能窄，這樣洗脫出的峰形好D親和層析10外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化親和層析的基本概念親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析配基的性質(zhì)與選擇親和層析的基本操作親和層析的基本概念

親和層析是利用待分離物質(zhì)與其特異性配體之間特異性的親和力進(jìn)行分離的一類特殊的層析技術(shù)，它有如下特點(diǎn)：純化過程簡單、迅速，且分離效率高特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子親和層析的基本特點(diǎn)純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件因此應(yīng)用范圍受到一定的限制親和層析的基