液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定人血漿中艾芬地爾

愛芬吉爾是一種抗血小板聚集酶的競爭抑制劑，用于抗血小板聚集酶，改變血液中的粘度，調(diào)節(jié)血管和抗血小板聚集。其結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)式見圖1-a)與去甲腎上腺素相似,因此可以替代后者作用于α-腎上腺素受體而沒有神經(jīng)遞質(zhì)的作用。艾芬地爾作用于大腦內(nèi)的α-腎上腺素受體,使充血區(qū)到缺血區(qū)的血液重新分布,從而改善腦循環(huán)、調(diào)節(jié)腦代謝。關(guān)于艾芬地爾分析方法的報(bào)道較少。氣相色譜(GC)曾被應(yīng)用于動(dòng)物血漿中艾芬地爾的檢測。本實(shí)驗(yàn)中,我們以酮康唑(結(jié)構(gòu)式見圖1-b)為內(nèi)標(biāo),采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定人血漿中的艾芬地爾的含量。并將此方法應(yīng)用于11名健康受試者靜脈滴注10,20,40mg艾芬地爾的藥代動(dòng)力學(xué)研究。1實(shí)驗(yàn)部分1.1試劑和血漿艾芬地爾和酮康唑購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純)和乙酸乙酯(色譜純)購自SKChemicals(Ulsan,Korea);甲酸和乙酸銨(色譜純)購自Sigma-AldrichChemieGmbH;氨水(分析純)購自重慶市西南醫(yī)院試劑中心;空白人血漿購自重慶市西南醫(yī)院血液中心;實(shí)驗(yàn)過程中使用Milli-Q超純水。1.2高效液相色譜儀和水-環(huán)境質(zhì)量儀AB公司QTRAPTM型質(zhì)譜儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,加拿大),配有電噴霧離子源(ESI);1100系列高效液相色譜儀(意大利安捷倫科技),配有G1311A泵、G1316A自動(dòng)進(jìn)樣器和G1313A柱溫箱;Reacti-ThermTM氮吹儀(Pierce);數(shù)據(jù)采集、色譜峰積分和校正采用ABAnalyst1.4軟件處理(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司,加拿大)。1.3乙酸銨條件下柱溫度采用UltraC18分析柱(150mm×2.1mm,5μm,Resteck);柱溫:30℃;流動(dòng)相為甲醇-6mmol/L乙酸銨溶液(pH7.40)(體積比為90∶10);流速:0.2mL/min;進(jìn)樣量:5μL。1.4艾芬地爾和其他離子的質(zhì)譜圖艾芬地爾和酮康唑的離子化采用電噴霧離子源,正離子模式。電噴霧的參數(shù)如下:氣簾氣(氮?dú)?269kPa(39psi),霧化氣441kPa(64psi),輔助加熱氣303kPa(44psi),離子源溫度350℃,離子噴霧電壓5400V,母離子和子離子的質(zhì)譜圖在選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)下采集。艾芬地爾和內(nèi)標(biāo)的去簇電壓、入口電壓、碰撞能、碰撞池入口電壓、出口電壓優(yōu)化參數(shù)及其監(jiān)測的離子對見表1。1)DP:declusteringpotential;2)EP:entrancepotential;3)CE:collisionenergy;4)CEP:collisioncellentrancepotential;5)CXP:collisioncellexitpotential.1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制將艾芬地爾和內(nèi)標(biāo)溶于甲醇配成1g/L溶液,并稀釋至1mg/L作為儲(chǔ)備液,保存于4℃冰箱中。內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至0.8mg/L。向1.0mL空白血漿中添加適量的艾芬地爾儲(chǔ)備液,使艾芬地爾在血漿中的有效質(zhì)量濃度為0.25,0.5,1,2,5,10,25,50μg/L,從而制得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。取空白血漿按上述方法配制含艾芬地爾0.5,5.0和50.0μg/L3個(gè)水平的質(zhì)量控制(QC)樣品。1.6血漿樣品處理將10μL內(nèi)標(biāo)溶液加入到所有的質(zhì)控樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(第一個(gè)空白樣品除外)中,然后渦流混勻30s。所有的質(zhì)控樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測血漿樣品都經(jīng)過液-液提取處理。向每個(gè)血漿樣品(0.5mL)中加入0.5mL氨水(pH9.7),渦流混勻1min,然后加入4.0mL乙酸乙酯,渦流混勻1min,于3000r/min離心10min。每個(gè)樣品取3.0mL有機(jī)相轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)管中,于50℃條件下用氮?dú)饬鞔蹈?。最?樣品組分用100μL甲醇溶解,渦流混勻30s。將樣品轉(zhuǎn)移至HPLC樣品瓶中,上樣5μL進(jìn)行分析。2結(jié)果和討論2.1不同子離子和內(nèi)標(biāo)強(qiáng)度的血漿樣品的srm色譜圖在Q1掃描模式下,艾芬地爾和內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生了質(zhì)子化的母離子[M+H]+。在譜圖中可觀察到艾芬地爾的主要離子為m/z326.1,內(nèi)標(biāo)的主要離子為m/z531.0。MS/MS譜圖中,艾芬地爾強(qiáng)度最高的子離子為m/z308.2,內(nèi)標(biāo)強(qiáng)度最高的子離子為m/z82.1(見圖2和圖3)。經(jīng)提取處理的空白血漿樣品和含有1.0μg/L分析物的血漿樣品的SRM色譜圖分別見圖4和圖5。由于MS/MS技術(shù)的高選擇性,這兩個(gè)分析物之間沒有觀察到干擾,且兩化合物的出峰處沒有內(nèi)源性峰的干擾,也沒有觀察到離子抑制現(xiàn)象。2.2方法的精密度和準(zhǔn)確度、回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明,在0.25~50μg/L這一濃度范圍內(nèi),峰面積比(Y)與質(zhì)量濃度(C,μg/L)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。線性方程為Y=0.217C+0.0095(r=0.9995,n=8)。檢測限(LOD)為0.08μg/L(S/N≥3)。對于靈敏度的測定,標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度被認(rèn)為是定量限,因此艾芬地爾的定量限(LOQ)為0.25μg/L,此濃度下艾芬地爾峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于20%,標(biāo)準(zhǔn)曲線上其他各點(diǎn)的峰面積的RSD小于15%。該測定方法的日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度通過分析每個(gè)水平的5個(gè)質(zhì)量控制樣品來判斷。結(jié)果表明,日內(nèi)的準(zhǔn)確度為97.6%~111.8%,日內(nèi)的精密度(RSD)為0.04%~1.57%。實(shí)際樣品測定的精密度和準(zhǔn)確度的RSD在可接受的范圍(±15%)內(nèi)。結(jié)果見表2。日間的精密度和準(zhǔn)確度通過在5d內(nèi)分析15個(gè)質(zhì)量控制樣品來判斷,其結(jié)果在精密度和準(zhǔn)確度可接受的范圍內(nèi),即實(shí)際樣品測定的RSD在±15%之間。結(jié)果見表2。艾芬地爾的相對回收率通過在3個(gè)質(zhì)量控制水平上(0.5,5.0,50.0μg/L)血漿樣品,以提取后的色譜峰面積與相同濃度樣品未經(jīng)提取獲得的色譜峰面積之比進(jìn)行考察。結(jié)果見表2。在不同溫度和儲(chǔ)藏時(shí)間條件下考察了人血漿和儲(chǔ)備液中的艾芬地爾的穩(wěn)定性。在短期穩(wěn)定性考察過程中,將保存的血漿樣品解凍,保存于室溫(25℃)條件下,于0,2,4,7h取樣測定,然后按樣品制備的方法處理。短期穩(wěn)定性的測定結(jié)果(見表3)表明在正常運(yùn)行的試驗(yàn)條件下可以接受。在長期穩(wěn)定性考察過程中,將血漿樣品保存于-70℃條件下,于第7d,14d,28d按樣品制備的方法處理后測定,結(jié)果見表3。在反復(fù)凍融穩(wěn)定性考察過程中,將保存于-70℃條件下的血漿樣品反復(fù)凍融3次后,按樣品制備的方法處理后測定,結(jié)果見表3。這些結(jié)果表明艾芬地爾保存在-70℃條件下是合適的,在常規(guī)的藥代動(dòng)力學(xué)研究中并沒有出現(xiàn)穩(wěn)定性相關(guān)的問題。2.3空白血漿的測定試驗(yàn)過程中并沒有觀察到離子抑制現(xiàn)象。在樣品制備的過程中,測定了來自6個(gè)人的空白血漿。