蝴蝶蘭組織培養(yǎng)研究進展

蝴蝶蘭花也被稱為蝴蝶蘭，它的花形狀奇特，色彩鮮艷，花期長，具有很高的觀賞和經(jīng)濟價值。它是國際上最具商業(yè)價值的四種觀賞熱帶蘭之一。由于蝴蝶蘭屬于單莖性氣生蘭,再生能力弱,很難進行分株繁殖,且種子非常細小,在自然條件下很難萌發(fā),增殖系數(shù)很低,比其他蘭花更難以進行常規(guī)的無性繁殖,不能滿足日益增長的市場需求。因此,研究蝴蝶蘭的繁殖具有重要的意義。組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的有效途徑。近些年,出現(xiàn)了不少以蝴蝶蘭的葉片、根尖、莖尖、花梗等外植體進行組織培養(yǎng)的報道,但尚有許多環(huán)節(jié)需要改進。蝴蝶蘭組織培養(yǎng)程序一般為:選取外植體(葉片、根尖、莖尖、花梗等)→誘導形成原球莖(PLB)→原球莖大量增殖→分化出小植株→生根壯苗培養(yǎng)→溫室移栽。筆者對蝴蝶蘭組織培養(yǎng)的研究進展進行了闡述。1蝴蝶蘭的繁殖1.1根據(jù)離體器官，原球莖被誘導生長1.1.1新培養(yǎng)葉片的原球莖(1)以葉片為外植體。以葉片為外植體誘導原球莖具有取材容易、廣泛、不損害母株等優(yōu)點。Ishii等認為,在添加蔗糖的培養(yǎng)基中,以葉片為外植體沒有原球莖產(chǎn)生,葉片誘導比較困難,一般需要高濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑。Park等將無菌苗葉片切成5mm×10mm大小,接種于MS+6!BA15mg/L+NAA1mg/L培養(yǎng)基上,8周后誘導出原球莖。劉林取蝴蝶蘭花莖莖節(jié)在無菌條件下培養(yǎng)長成幼枝上的葉片切塊作外植體,在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果表明,培養(yǎng)基中加1mg/LNAA、10mg/L腺嘌呤、10mg/L6!BA、1%瓊脂和2%蔗糖,容易產(chǎn)生原球莖。蔡斌以花梗芽培養(yǎng)所得的無菌莖芽頂部展開的新葉為外植體進行培養(yǎng),一個月后切口邊緣的葉面上有白色的原球莖形成。研究同時表明,6!BA和KT不能使葉塊誘導出原球莖,而培養(yǎng)基中添加椰子汁有利于葉塊分化出原球莖。馬杰等取市售瓶苗蝴蝶蘭幼嫩葉片,采用不同培養(yǎng)基對其進行誘導效果比較。結(jié)果表明,香蕉泥和椰乳(CM)對蝴蝶蘭外植體原球莖的形成具有明顯的促進作用。在MS+6!BA5.0mg/L+NAA2.0mg/L+香蕉泥10.0%+AC0.3%的培養(yǎng)基中,葉片原球莖的誘導率可達48.6%。Chen等以蒴果授粉萌發(fā)出的幼葉為外植體,接種于MS培養(yǎng)基上,通過試驗得出結(jié)論:當1cm長的葉片接種到附加0.1mg/L和1.0mg/LNAA的培養(yǎng)基上后,外植體幾乎全部死亡,沒有原球莖產(chǎn)生;當添加TDZ后20d,葉片表面即有原球莖產(chǎn)生。因此TDZ對蝴蝶蘭原球莖的形成有明顯的促進作用。(2)以根為外植體。以根為外植體誘導原球莖的報道較少。黃恩平、張云峰利用蝴蝶蘭實生苗根段在MS培養(yǎng)基上附加KT和NAA誘導出原球莖,誘導率為9.7%。張秀清等取蝴蝶蘭實生苗的根尖接種于培養(yǎng)基上,經(jīng)過50d培養(yǎng)后,在頂端長出原球莖,其誘導率在75%左右。李進進等用蝴蝶蘭新發(fā)生的根尖接種于B5+NAA1.5mg/L+CM150ml/L+3%蔗糖培基養(yǎng)上,2周后,根端切口處開始膨大,產(chǎn)生淡綠色瘤狀愈傷組織,并不斷擴大,成功誘導出原球莖。徐文華等以試管苗的氣生根為外植體,誘導培養(yǎng)基為MS+NAA1.0mg/L+Ad10mg/L,附加不同濃度的6!BA和CW20%,試驗結(jié)果表明,根尖幾乎沒有誘導出原球莖。(3)以莖尖為外植體。莖尖是細胞分裂最旺盛部分,成功率較高。潘學峰、黃鳳嬌以海南蝴蝶蘭試管苗莖尖為外植體,接種于MS、KC、VW3種培養(yǎng)基上,得出結(jié)論:KC培養(yǎng)基效果最好,平均誘導率為77.1%,其次是VW,最差是MS。單獨使用生長素NAA也不能產(chǎn)生原球莖;最好的配比6!BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L,原球莖的誘導率高達90%。王芳等以蝴蝶蘭小幼苗莖尖為外植體,接種在MS附加激素培養(yǎng)基上,培養(yǎng)25~30d,僅在低濃度下誘導出原球莖,6!BA0.5mg/L最好,誘導率40%。張偉等取新長出的莖尖為外植體,接種在N6培養(yǎng)基上,培養(yǎng)20d后,在不含IAA的培養(yǎng)基中,莖尖組織不能誘導生成原球莖;當KT為1.0mg/L、IAA為0.5mg/L時,原球莖的誘導率為100%。張元國在碩士論文中提到:莖尖相對其他外植體誘導率較高,達88.5%,最佳激素組合為MS+6!BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L。(4)以花梗為外植體。(1)直接以花梗為外植體。劉福林等將花梗切成約1.5~2.0mm的薄片,平放在固體培養(yǎng)基MS+6!BA1~2mg/L上,培養(yǎng)2周左右,可見外植體膨大,2個月后,圓球狀的突起增多,長成桑果狀原球莖,誘導率可達77%。魯雪華等以花梗節(jié)間段為外植體,接種后約30d開始出現(xiàn)膨大,2個月后有原球莖形成。同時得出結(jié)論:減少MS中大量元素和部分微量元素及有機成分,適當增加少量葉酸和生物素有利于原球莖的形成。在培養(yǎng)基中添加椰乳汁能夠明顯增加原球莖的發(fā)生率。最佳誘導培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基+6!BA5.0~7.5mg/L+NAA0.5~1.0mg/L+椰乳汁15%。陳勇等以盆栽苗的花梗切片為外植體,在常用的多種培養(yǎng)基上培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)花梗切片MS+10mg/LKT+5mg/LNAA培養(yǎng)基上有少量原球莖誘導產(chǎn)生。(2)以由花梗芽萌發(fā)的無菌苗離體器官為外植體。秦凡等將花梗切成帶腋芽的小段,接種于培養(yǎng)基中,結(jié)果表明,6!BA在濃度為5.0mg/L時萌發(fā)效果最好,然后將無根苗去葉取莖尖誘導原球莖,得出莖尖誘導以M1+6!BA3.0為最佳。張元國等將休眠的花梗腋芽啟動,在三角瓶內(nèi)長成無菌植株,利用無菌植株的莖尖、葉子、根尖等誘導原球莖狀體進行快速繁殖。結(jié)果表明,培養(yǎng)基MS+6!BA3.0mg/L出芽率最高,可達90%;MS+6!BA5.0mg/L+NAA0.5mg/L誘導率最高,可達100%。張啟香等通過誘導殘敗花梗上的休眠芽萌發(fā),以萌發(fā)的幼葉和去莖尖的莖段為外植體進行組織培養(yǎng),并篩選出最佳培養(yǎng)基組成:MS+6!BA3.0mg/L+ZT0.5mg/L+檸檬酸30mg/L;MS+6!BA5.0mg/L+檸檬酸30mg/L+30%椰乳。曹修才等取新抽出的花梗為外植體,接種到培養(yǎng)基上,40d后各種培養(yǎng)基的花梗腋芽都能萌發(fā),再利用葉片誘導原球莖,得出最佳培養(yǎng)基為1/2MS+6!BA10.0mg/L+NAA1.0mg/L,原球莖誘導率為85%。1.1.2培養(yǎng)基對植物基因型的影響葉曉青等以繁殖系數(shù)為指標,在不同激素水平的MS培養(yǎng)基上,對蝴蝶蘭原球莖的繁殖進行研究。結(jié)果表明,在激素水平6!BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L的培養(yǎng)基上,繁殖系數(shù)達4倍以上;NAA對原球莖的增殖有維持作用;5%的低質(zhì)量濃度椰乳也有利于原球莖增殖。周俊輝等就添加1~7mg/L6!BA和1mg/LNAA的MS、1/3MS和改良KC3種基本培養(yǎng)基對蝴蝶蘭原球莖增殖的影響進行了研究。結(jié)果表明,改良KC的效果最好,1/3MS的效果次之,MS的效果最差。在改良KC基本培養(yǎng)基中,加入6!BA的濃度以1mg/L對原球莖增殖的效果最好,隨6!BA濃度的增加原球莖增殖率下降。劉曉燕等以原球莖為外植體進行培養(yǎng),比較不同基本培養(yǎng)基、有機添加物和植物激素等因子對蝴蝶蘭原球莖增殖效果的影響。結(jié)果表明,以改良VW為基本培養(yǎng)基對促進原球莖增殖的效果優(yōu)于MS基本培養(yǎng)基,在MS為基本培養(yǎng)基時,削減大量元素的用量有利于PLB的增殖。使用有機添加物對原球莖增殖有影響,其中以椰乳增殖效果最好,6!BA及NAA的使用濃度決定PLB繼續(xù)增殖或分化的方向以及進行的速度。葉小曲在碩士論文中提到將原球莖轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中,通過正交試驗得出原球莖增殖最佳培養(yǎng)基G3+6!BA10.0mg/L+NAA1.0mg/L+活性炭0.2%。Tsu!Hwie等把原球莖切割成2cm×2cm小塊進行增殖,增殖培養(yǎng)基為KC+蛋白胨1g/L+蘋果酸30mg/L+椰汁150mg/L,同時添加2%海藻糖或蔗糖以及1g/L活性炭。結(jié)果表明,在添加海藻糖的固體培養(yǎng)基上,原球莖的增殖率是添加蔗糖的2倍多,同時在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)比在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得更高的增殖率。1.1.3培養(yǎng)基和糖液p、vw快速增殖原球莖并誘導分化成苗是實現(xiàn)蝴蝶蘭工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵。何松林等以蝴蝶蘭原球莖為材料,比較不同基本培養(yǎng)基、不同碳源和不同培養(yǎng)基添加物對蝴蝶蘭原球莖幼苗分化的影響。結(jié)果表明,以NP和VW為基本培養(yǎng)基時,原球莖分化幼苗優(yōu)于MS培養(yǎng)基;3種培養(yǎng)基添加物中,椰子汁和馬鈴薯優(yōu)于香蕉;3種碳源相比較,蔗糖有利于苗的分化和生長。王芳等通過研究激素對蝴蝶蘭原球莖分化的影響,得出結(jié)論,6!BA與NAA組合配比為2∶1時分化率達最高值100%。姚麗娟等通過試驗得出分化率則以VW最高,達57%;NAA濃度對原球莖增殖分化的影響均不明顯。徐曉薇等以蝴蝶蘭花梗誘導的原球莖為材料,對其進行研究,結(jié)果表明,較高的蔗糖含量(6%)和植物生長調(diào)節(jié)劑組合(6!BA0.01mg/L+2,4!D0.1mg/L)能有效促進原球莖的分化。1.1.4研究生根的誘導生根在培養(yǎng)基中添加蘋果汁、香蕉汁、椰乳、土豆泥、低濃度的生長素和多效唑可促進生根壯苗。胡海英、王建宇將原球莖定植于KC+NAA0.2mg/L+5%馬鈴薯+10%椰乳的培養(yǎng)基上,15d后,其根分化出來,并生長健壯。Wang等將原球莖轉(zhuǎn)接在添加0.1mg/LIAA的培養(yǎng)基上,14d形成根,生根誘導率為40%。楊建國在碩士論文研究中得出:單獨使用NAA0.5mg/L為好;隨著6!BA濃度的增高,生根率反而下降;誘導生根較為理想的濃度比為6!BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L,生根率高,根數(shù)多,根長。李麗等選取NAA、IBA兩種植物生長物質(zhì)和蔗糖3個因子,每個因子取3個水平,用正交設(shè)計研究生根試驗。結(jié)果表明,NAA對蝴蝶蘭生根的影響較大,蔗糖次之,而IBA的影響最小,得出蝴蝶蘭無根苗生根的最佳培養(yǎng)基為:1/2MS+NAA0.2mg/L+IBA0.1mg/L+蔗糖20g/L。1.2種子原球莖的誘導蘭花種子的萌發(fā)有兩種方法,即共生萌發(fā)與非共生萌發(fā)(無菌播種)。無菌播種適于大多數(shù)熱帶氣生蘭的種子萌發(fā)。姚麗娟等通過對蝴蝶蘭雜交種子進行無菌播種培養(yǎng),得出改良KC培養(yǎng)基是適合蝴蝶蘭種子發(fā)芽、生育的最佳培養(yǎng)基;添加10%的椰乳或香蕉汁,對種子萌發(fā)均有促進作用,椰乳效果好于香蕉汁。丁峰等取蝴蝶蘭不同品種成熟蒴果中的種子進行無菌播種,誘導形成原球莖狀球體。結(jié)果表明,對各供試成熟蒴果種子的誘導均獲成功;最適于種子原球莖產(chǎn)生的培養(yǎng)基為花寶1號+6!BA3mg/L+NAA0.05mg/L+10%~15%香蕉汁,種子萌發(fā)率高達95%。范五成等取生長120d的蒴果,播種于MS+6!BA1mg/L+NAA0.1mg/L+AC2mg/L的培養(yǎng)基中,70d左右可出苗,出苗率達100%。陳超等通過對種子播種方法的比較,得出稀釋法結(jié)果較好,種子分布均勻,且原球莖發(fā)育健壯整齊。1.3叢生芽的誘導誘導不經(jīng)過愈傷組織直接誘導叢生芽,是蝴蝶蘭快速繁殖的又一個途徑。劉榮維等通過花梗腋芽誘導叢生芽,著重研究增殖和壯苗培養(yǎng)。結(jié)果表明,隨著6!BA濃度的提高,叢生芽增殖率上升;添加椰汁有利于增殖率的提高,而且長勢較好;適當增加培養(yǎng)室光照并加入香蕉和土豆等有機物能促進根系生長,使蝴蝶蘭苗更健壯。祁素萍在碩士論文研究試驗中通過花梗腋芽誘導叢生芽,結(jié)果表明,在MS+6!BA5.0mg/L+NAA1mg/L培養(yǎng)基中誘導率最高,達50%左右;在生根培養(yǎng)中,MS+活性炭0.6g/L培養(yǎng)基的生根效果最好,生根量多,且根粗壯。潘學峰等誘導花梗休眠芽轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)芽,結(jié)果表明,花梗芽在培養(yǎng)基MS+6!BA5.0mg/L+NAA0.05mg/L上能夠誘導產(chǎn)生叢生芽;在叢生芽增殖階段,以6!BA12.5mg/L+NAA0.05mg/L的增殖效果最好;在生根階段以1/2MS+NAA0.5mg/L+0.2%活性炭+10%椰子水的生根效果較佳,生根率可達100%,且植株生長健壯。王玉英等研究表明,KT能降低培養(yǎng)基的褐化程度,而1/2MS+6!BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+8%香蕉泥最有利于蝴蝶蘭叢生芽的增殖,增殖率高,且葉片健壯;1/2MS+NAA1.0mg/L+8%香蕉泥有利于促進生根。2培養(yǎng)基及光照對植物基干和外植體總酚含量的影響外植體褐變是植物組織培養(yǎng)中遇到的重要問題。有研究表明,導致褐化的主要原因是由多酚氧化酶作用于天然底物酚類物質(zhì)形成醌而引起的,通過加入抗氧化劑和吸附劑可較好地控制褐化現(xiàn)象發(fā)生。姚麗娟等認為,在培養(yǎng)基中添加1~2g/L活性炭,適時切除培養(yǎng)物的褐化部分,及時更換新鮮培養(yǎng)基,能有效地抑制外植體褐變死亡的發(fā)生;培養(yǎng)基中加入10%椰子水,能促進原球莖的生長,減少原球莖增殖過程中的褐變。劉真華等系統(tǒng)研究了吸附劑(活性炭、聚乙烯基吡咚烷酮PVP)與檸檬酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、維生素C和硫代硫酸鈉5種抗氧化劑對蝴蝶蘭組培中褐化的影響。結(jié)果表明,活性炭能有效控制褐化和促進生長,但不利于分化;谷胱甘肽200mg/L控制褐化的效果雖不及活性炭,但綜合效果最佳,既能較好地抑制褐化,又能促進生長和分化。許傳俊等通過培養(yǎng)基及光照對蝴蝶蘭葉片外植體褐變的影響試驗結(jié)果表明,蝴蝶蘭葉片外植體在MS紙橋培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d發(fā)生褐變率較低,MS、B5和