連錢(qián)草愈傷組織培養(yǎng)的研究

連金草是著名的血毒癥、金錢(qián)草和佛耳草科。這是嘴唇科的一種活血藥物。它具有清熱解毒、利尿、祛石、驅(qū)瘀消腫的功效。它用于治療尿結(jié)石、肝結(jié)石、濕熱黃疸、跌倒和碰撞損傷等癥狀。已被《中華人民共和國(guó)藥典》收錄。連錢(qián)草莖、葉含揮發(fā)油，其有效成分為松樟酮、薄荷酮、異薄荷酮、番薄荷酮等，尚含熊果酸、琥珀酸多種化學(xué)成分，但天然植物體內(nèi)化學(xué)成分的含量較低，要提取其化學(xué)成分就要大量開(kāi)采連錢(qián)草植株，這對(duì)生態(tài)平衡有一定破壞作用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)植物組織培養(yǎng)方法，可以生產(chǎn)天然的植物成分并提高某些植物成分的含量，如通過(guò)對(duì)紅豆杉(Taxuschinensis(Pilg．)Rehd．)愈傷組織培養(yǎng)，使紫杉醇及三尖杉醇的含量均高于外值體中的含量。目前，對(duì)于唇形科藥用植物的愈傷組織培養(yǎng)已有一些報(bào)道，但有關(guān)連錢(qián)草愈傷組織培養(yǎng)國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。本研究基于上述研究現(xiàn)狀，對(duì)連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)行初步探索，獲得連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)及增殖的適宜培養(yǎng)條件，為建立大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)連錢(qián)草有效藥用成分提供了必要前提條件。1材料和方法1.1材料表面愈傷組織培養(yǎng)所用的外植體來(lái)自于嘉陵江流域南充段野生連錢(qián)草。1.2組織損傷的誘導(dǎo)和培養(yǎng)1.2.1培養(yǎng)條件優(yōu)化于2～6月陸續(xù)從母株上取8cm左右的頂芽、葉、葉柄，自來(lái)水沖洗表面雜物，洗潔凈溶液浸泡10min，自來(lái)水沖洗20min，雙蒸水清洗外植體后，放入培養(yǎng)皿內(nèi)，酒精擦拭后放入超凈工作臺(tái)。70%乙醇，浸泡消毒30s，雙蒸水清洗4次。次氯酸鈉浸泡1～15min(視材料的幼嫩程度而定)，放入培養(yǎng)皿中雙蒸水清洗數(shù)次。剪取頂芽(0.5～1cm)、葉片(0.5cm×0.5cm)、葉柄(0.5cm)、接種到培養(yǎng)基上。1.2.2細(xì)胞分裂素ba、kt和4-d的體外培養(yǎng)選用基本培養(yǎng)基MS和LS，改良后分別添加不同類(lèi)型和濃度的生長(zhǎng)素2,4-D、NAA和細(xì)胞分裂素BA、KT,30g·L-1蔗糖，8g·L-1瓊脂，0.1mol·L-1NaOH和0.1mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH為5.8，高壓(121℃)滅菌15min。1.2.3誘導(dǎo)過(guò)程光照條件置于HPG-280H人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為(24±2)℃。誘導(dǎo)過(guò)程光照條件分兩種處理:24h暗啟動(dòng)培養(yǎng)后光、暗交替培養(yǎng)(14h光照，10h黑暗)，光照強(qiáng)度2000lx;全程黑暗培養(yǎng)。1.3人工氣候箱在誘導(dǎo)過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)外植體染菌，則馬上將此瓶取出人工氣候箱。培養(yǎng)30d后，將未染菌外植體計(jì)算誘導(dǎo)率，計(jì)算公式如下:出愈率(%)=(出愈外植體快數(shù)×100)÷(接種數(shù)-染菌快數(shù))1.4增殖率的測(cè)定先稱量繼代接種前培養(yǎng)瓶的重量，再稱接種后的重量，從而得到接種的愈傷組織重量。培養(yǎng)14d后，再次進(jìn)行接種，按同上方法測(cè)知14d后愈傷組織的重量，通過(guò)以下公式求增殖率:接種鮮重(mg/瓶)=接種后瓶重(mg)-接種前瓶重(mg)收獲鮮重(mg/瓶)=收獲前瓶重(mg)-收獲后瓶重(mg)增殖率(%)=收獲鮮重÷接種鮮重×100%2結(jié)果與分析2.1外植體來(lái)源消毒效果以野外生長(zhǎng)和室內(nèi)盆栽生長(zhǎng)一段時(shí)間后新生幼葉為外植體，用2%的NaClO溶液各消毒2min，試驗(yàn)外植體來(lái)源不同對(duì)消毒效果的影響(表1)。結(jié)果表明:在其它條件相同情況下，野生植株的污染較為嚴(yán)重，污染率達(dá)45%，而室內(nèi)盆栽植株污染率僅為16.67%。表1列出了野外和室內(nèi)栽種外植體來(lái)源分別對(duì)消毒效果的影響情況。2.2ms培養(yǎng)基不同培養(yǎng)條件對(duì)連錢(qián)草誘導(dǎo)率的影響基本培養(yǎng)基的類(lèi)型是愈傷組織誘導(dǎo)的一個(gè)重要影響因素，本試驗(yàn)選用MS、LS培養(yǎng)基，分別添加2mg·L-1的2,4-D調(diào)整pH到5.8，經(jīng)加熱溶解后，分裝至50mL三角瓶中，每瓶20mL,0.15MPa壓強(qiáng)下消毒15min后冷卻，在超菌工作臺(tái)內(nèi)接種后放置于光、暗交替培養(yǎng)和暗培養(yǎng)。30d后觀察并計(jì)算連錢(qián)草在兩種培養(yǎng)基下出愈率(表2)。通過(guò)試驗(yàn)得知，連錢(qián)草在MS培養(yǎng)基光、暗交替條件下誘導(dǎo)率最高(54.23%);在LS暗培養(yǎng)條件下次之(34.43%);在MS培養(yǎng)基暗培養(yǎng)條件下和在LS光、暗交替培養(yǎng)條件下都相對(duì)很低。因此，MS培養(yǎng)基在光、暗交替培養(yǎng)條件下對(duì)連錢(qián)草外植體愈傷組織誘導(dǎo)最為有利。2.3植物激素的篩選2.3.1不同濃度同生長(zhǎng)素對(duì)連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)率的影響選擇MS基本培養(yǎng)基配比以不同濃度的生長(zhǎng)素2,4-D和NAA接種外植體于光、暗交替培養(yǎng)，以篩選出最優(yōu)化的生長(zhǎng)素及其對(duì)連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)的最適濃度(表3)。試驗(yàn)表明，不同生長(zhǎng)素對(duì)連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)具有顯著差異:2,4-D比NAA更適合于連錢(qián)草愈傷組織的誘導(dǎo)，在2,4-D與BA(1.0mg·L-1)組合的培養(yǎng)基上，連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)率整體都較高，并且在一定范圍內(nèi)隨著2,4-D濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率隨著增加，當(dāng)濃度達(dá)到1.5mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到一個(gè)最大值，當(dāng)其濃度再增加時(shí)，則抑制愈傷組織誘導(dǎo)，因此，誘導(dǎo)率又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在NAA與BA(1.0mg·L-1)組合的培養(yǎng)基上，連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)率很低，說(shuō)明NAA不適于連錢(qián)草外植體脫分化成愈傷組織。2.3.2,4-d1.5.4整體誘導(dǎo)大鼠愈傷組織誘導(dǎo)率植物愈傷組織誘導(dǎo)的優(yōu)化通常需要生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素協(xié)調(diào)。因此，在MS光、暗交替培養(yǎng)，得出選取2,4-D(1.5mg·L-1)的最適生長(zhǎng)素條件下，配比以兩種不同濃度的細(xì)胞分裂素BA、KT進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)(表4)。試驗(yàn)顯示，BA和KT都能與2,4-D(1.5mg·L-1)組合誘導(dǎo)出連錢(qián)草愈傷組織。BA在0～1mg·L-1范圍內(nèi)，隨著濃度增加，誘導(dǎo)率增大，當(dāng)BA濃度大于1mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率開(kāi)始下降，說(shuō)明高濃度(>1mg·L-1)BA抑制愈傷組織誘導(dǎo);KT則在0.5mg·L-1時(shí)最為適宜，當(dāng)大于0.5mg·L-1時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)即受到抑制，低濃度(<0.5mg·L-1)KT適宜于連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)。綜合比較，連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)在MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1mg·L-1)組合的培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)率最高。2.4錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)以葉片、莖尖和葉柄為外植體，接種于MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1.0mg·L-1)培養(yǎng)基上，試驗(yàn)連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)情況(表5)。結(jié)果顯示:莖尖的愈傷組織誘導(dǎo)率非常低，不適宜于連錢(qián)草愈傷組織的誘導(dǎo);葉和葉柄均可誘導(dǎo)形成愈傷組織，葉誘導(dǎo)率達(dá)91.38%，葉柄誘導(dǎo)率達(dá)100%;兩種外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織在生理形態(tài)上有一定的細(xì)微差異，葉誘導(dǎo)出的愈傷組織呈白色略黃，疏松。葉柄誘導(dǎo)出的愈傷組織呈黃色，緊密。并且通過(guò)對(duì)比得知，葉誘導(dǎo)出的愈傷組織增殖明顯比葉柄快(圖1)。2.5債權(quán)配比培養(yǎng)基上的增值率選擇健康愈傷組織分成小塊接種于新鮮培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。14d后，再次繼代接種，記錄數(shù)據(jù)，探討愈傷組織在2,4-D和BA配比培養(yǎng)基上的增值率(表6)。結(jié)果表明，連錢(qián)草愈傷組織增殖率較低，在MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1.0mg·L-1)培養(yǎng)基下，增殖率達(dá)到最大(202.2%)，當(dāng)2,4-D濃度超過(guò)2.0mg·L-1時(shí)，愈傷組織呈灰黃色，并且極易褐化。3連錢(qián)草愈傷組織的誘導(dǎo)連錢(qián)草體表被柔毛，野生植株污染嚴(yán)重，多次接種都難獲得無(wú)菌的材料，應(yīng)采取嚴(yán)格的預(yù)防措施，先將野生植物樣本掘出，剪除一些不必要的部分，改為室內(nèi)盆栽，等它們長(zhǎng)出新苗后，再行采樣接種，可以大大增加無(wú)菌材料獲得率。通過(guò)添加以生長(zhǎng)素2,4-D的基本培養(yǎng)基試驗(yàn)連錢(qián)外植體誘導(dǎo)得知:MS在光暗交替條件下和LS在黑暗條件下均可誘導(dǎo)連錢(qián)草愈傷組織的形成。MS基本培養(yǎng)基在植物愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中已被廣泛的采用，同為唇形科藥用植物的丹參(SalviamiltiorrhizaBge．)、紫蘇(Perillafrutescens)、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorg)皆有以MS基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織形成的報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基也是連錢(qián)草愈傷組織誘導(dǎo)生長(zhǎng)的適宜培養(yǎng)基。而以LS培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)愈傷組織的卻較少，HirobumiYamamoto等以LS為基本培養(yǎng)基，成功誘導(dǎo)出小檗科植物淫羊藿(Epimediumdiphyllum)愈傷組織，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在LS培養(yǎng)基上也能誘導(dǎo)出連錢(qián)草愈傷組織，但在后來(lái)的愈傷組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)LS培養(yǎng)基中的愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，因此，在LS培養(yǎng)基上，連錢(qián)草愈傷組織培養(yǎng)條件還需要進(jìn)一步研究。通過(guò)在MS基本培養(yǎng)基光、暗交替培養(yǎng)條件下植物激素的篩選實(shí)驗(yàn)得知:植物激素是連錢(qián)草外植體脫分化為愈傷組織的重要影響因素。生長(zhǎng)素2,4-D能促進(jìn)連錢(qián)草外植體脫分化形成愈傷組織，而NAA則抑制愈傷組織的形成;細(xì)胞分裂素KT和BA均能促進(jìn)連錢(qián)草愈傷組織的形成。其誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基是MS+2,4-D(1.5mg·L-1)+BA(1.0mg·L-1)，在此條件下以葉為外植體，誘導(dǎo)率可達(dá)91.38%;以葉柄為外植體，誘導(dǎo)率高達(dá)100%;但連錢(qián)草莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率卻很低，肖關(guān)麗等對(duì)甘蔗(Saccharumsinensis)不同葉位幼葉鞘內(nèi)源激素與愈傷誘導(dǎo)率關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗不同葉位幼葉鞘內(nèi)源激素的差異與愈傷組織誘導(dǎo)率有關(guān)，連錢(qián)草莖尖愈傷組織誘導(dǎo)率低亦可能與其莖尖分生組織中