高效液相色譜法測定連錢草中齊墩果酸和熊果酸的含量

連草是活血草科植物的一種昵稱，頭骨干燥，經(jīng)絡(luò)分散，皮膚香味，江蘇金錢草；《中華人民共和國藥典》2005年版收錄了嘴唇科植物的活血丹龍目的（nakai）kubar干燥的土壤部分，具有潤濕、祛瘀、殺瘀、祛斑的功能。對于連錢草藥材的質(zhì)量控制,《中華人民共和國藥典》(2005年版一部)主要通過性狀、顯微特征和熊果酸的薄層色譜來鑒別藥材的真?zhèn)?通過檢查雜質(zhì)、水分、總灰分和酸不溶性灰分以及測定醇溶性浸出物的含量來控制藥材的質(zhì)量。近年來,有學(xué)者相繼報(bào)道連錢草中三萜酸類成分(主要為熊果酸和齊墩果酸)和總黃酮的含量測定方法,并以此來控制該藥材的質(zhì)量,但主要限于江蘇、安徽兩地產(chǎn)的連錢草藥材。湖北省連錢草資源非常豐富,但其利用極為有限,主要在民間用于治療少兒腹瀉,筆者未見有關(guān)湖北產(chǎn)地連錢草藥材質(zhì)量控制方面的報(bào)道。筆者在本研究通過高效液相色譜(HPLC)法對5個湖北產(chǎn)地(8個批次)、3個其他省份連錢草中兩種主要化學(xué)成分齊墩果酸和熊果酸的含量進(jìn)行測定并比較評價,同時對3種連錢草混淆品中的齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行考察,為湖北省連錢草資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù),也為連錢草藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提升提供數(shù)據(jù)參考。1儀器和試劑盒1.1u3000試驗(yàn)設(shè)備SUMMIT型高效液相色譜儀(戴安,美國),包括ASI-100TM自動進(jìn)樣器,TCC-100柱溫箱,PDA-100二級管陣列檢測器,P680泵。超聲波清洗器(JL.120,上海杰理科技有限公司)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(SHZ-3,上海亞榮生化儀器廠)。1.2實(shí)驗(yàn)試劑與材料甲醇(色譜純,FisherScientific),甲醇(分析純,天津市博迪化工有限公司),乙腈(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),冰醋酸(分析純,天津市博迪化工有限公司),實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。齊墩果酸對照品(色譜級,上海友思生物技術(shù)有限公司),熊果酸對照品(色譜級)。連錢草樣品見表1。連錢草自行采集后,除去雜質(zhì),自然晾干,粉碎,過篩孔內(nèi)徑960μm(20目)篩,使用前60℃干燥3h。另取恩施3的連錢草樣品,將其莖和葉分開,待用。2方法和結(jié)果2.1決策及色譜條件色譜柱:大連依利特HypersilODS2(4.6mm×200mm,5μm);流動相:甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液(40:40:20);流速:1.0mL·min-1;檢測波長:210nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20μL,所有待分析樣品,進(jìn)樣分析前均用0.22μm有機(jī)系微孔濾膜過濾。理論板數(shù)按熊果酸色譜峰>13000,分離度>1.28;拖尾因子在0.99～1.02之間。圖1和圖2分別是在此色譜條件下測得的齊墩果酸和熊果酸對照品溶液和連錢草甲醇提取物的色譜分離圖。2.2對照溶液的制備2.2.1對照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對照品0.0112g,用甲醇溶解并定容至25mL量瓶,搖勻,得齊墩果酸對照品儲備液,濃度為0.448mg·mL-1。2.2.2對照品溶液的制備精密稱取熊果酸對照品0.1000g,用甲醇溶解并定容至50mL量瓶,搖勻,得熊果酸對照品儲備液,濃度為2mg·mL-1。分別取適量體積的齊墩果酸和熊果酸對照品儲備液,用甲醇溶解并定容至10mL量瓶,搖勻,配制成一系列濃度的對照品溶液。2.3供試品溶液的制備分別稱取各產(chǎn)地連錢草10g,加入50mL甲醇,超聲提取30min,過濾,重復(fù)3次,合并濾液,減壓濃縮,用甲醇溶解并定容至25mL,得供試品溶液。2.4齊墩乳酸和熊蘋果的線性方程按照“2.2”項(xiàng)下方法配制一系列濃度的對照品溶液,以峰高(H)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸,得齊墩果酸的線性方程H=229.69C-4.7558,r=0.9997;熊果酸的線性方程H=265.46C-18.937,r=0.9997。結(jié)果表明齊墩果酸在0.04～0.20mg·mL-1,熊果酸在0.40～0.75mg·mL-1有良好的線性關(guān)系。2.5樣品的加樣回收按照“2.2”項(xiàng)下配制對照品溶液3份,每份對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣分析3次,測得齊墩果酸和熊果酸的峰高的RSD分別平均為0.80%和0.37%。2.6進(jìn)樣穩(wěn)定性試驗(yàn)稱取同一批藥材5份,按照“2.3”制得供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,測得齊墩果酸和熊果酸的峰高的RSD分別為1.95%和2.73%。結(jié)果表明,該方法重復(fù)性較好。2.7溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)稱取咸寧產(chǎn)地連錢草10g,按照“2.3”制得供試品溶液,在室溫(25℃)放置0,1,2,4,6,8,10h后分別進(jìn)樣,按上述色譜條件分析,齊墩果酸和熊果酸峰高的RSD分別為1.24%和1.68%,結(jié)果表明,供試品溶液在10h之內(nèi)穩(wěn)定。2.8加樣回收試驗(yàn)稱取已知含量的咸寧產(chǎn)地連錢草5g,分別加入齊墩果酸對照品0.0014g、熊果酸對照品0.0084g,按照“2.3”制得供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的加樣回收率分別為98.1%和97.9%(RSD分別為2.44%和1.83%,n=3)。2.9含量測定取11個批次連錢草、恩施3產(chǎn)地連錢草的莖、葉,按“2.3”制得供試品溶液,在上述色譜條件下進(jìn)樣分析,測定峰高,代入線性方程計(jì)算含量,結(jié)果見表2。3討論3.1甲醇與三氯甲烷的提取效果采用超聲提取法,考察三氯甲烷、甲醇、乙醇對連錢草中齊墩果酸和熊果酸提取效率的影響。結(jié)果表明,乙醇的提取效果最差,甲醇與三氯甲烷差異無顯著性?？紤]到三氯甲烷有較大的毒性,選用甲醇為提取溶劑。選用L9(34)正交表進(jìn)行正交設(shè)計(jì),考察提取時間、提取次數(shù)和提取體積對提取結(jié)果的影響。對正交結(jié)果進(jìn)行極差分析表明,確定最佳的提取條件提取時間為30min,提取次數(shù)為3次,提取體積為50mL。3.2色譜波長的影響在線全波長掃描圖顯示熊果酸最大吸收波長在206nm處,但是在此波長處甲醇溶劑的干擾很大。而選擇220nm為檢測波長,熊果酸的色譜峰高顯著降低。綜合考慮,選擇用210nm為檢測波長。3.3流動相組成對熊乳酸分離度的影響根據(jù)文獻(xiàn),本實(shí)驗(yàn)對甲醇:1%冰醋酸水溶液和甲醇:乙腈:1%冰醋酸水溶液兩種流動相組成及其比例進(jìn)行優(yōu)化。齊墩果酸和熊果酸的pKa分別為4.64和4.68。在流動相中加入冰醋酸,可抑制齊墩果酸和熊果酸解離,增加其在C18柱上的保留,從而增加二者的分離度。當(dāng)流動相組成為甲醇-1%冰醋酸水溶液時,熊果酸的柱效較低,理論塔板數(shù)<12000;而當(dāng)流動相中加入乙腈時,熊果酸的柱效顯著提高,理論塔板數(shù)>15000。因此,選擇甲醇:乙腈:1%冰醋酸水溶液為流動相組成成分。乙腈的含量對齊墩果酸和熊果酸的分離效果也有一定影響。當(dāng)乙腈含量從10%增加到20%,分離度增加,從20%增加到40%,分離度不變,但乙腈的含量繼續(xù)增加時分離度反而下降。考慮到柱效,本實(shí)驗(yàn)選擇40%(V/V)的乙腈。綜合以上結(jié)果,確定相對最優(yōu)的色譜條件為:甲醇-乙腈-1%冰醋酸(40:40:20)為流動相,流速為1.0mL·min-1,柱溫為30℃,檢測波長為210nm。3.4樣品含量測定結(jié)果表明,在上述11個批次的連錢草樣品中,貴州安順產(chǎn)地的齊墩果酸含量最低,江蘇連云港產(chǎn)地的熊果酸含量最低。安徽六安產(chǎn)地的齊墩果酸和熊果酸含量都最高。比較湖北恩施1和湖北恩施2兩個批次的連錢草樣品,5月份采收的連錢草中齊墩果酸和熊果酸的含量高于9月份采收的連錢草;比較湖北荊州1和荊州2兩個批次的連錢草樣品,野生的齊墩果酸和熊果酸含量高于家種?？傮w而言,湖北各個產(chǎn)地連錢草中齊墩果酸和熊果酸的含量均較高,且差別不大,但不同省份之間差別較大。上述結(jié)果表明,連錢草藥材的質(zhì)量與其生長環(huán)境密切相關(guān),與采收時間和栽培方式也有一定關(guān)系。比較恩施3莖、葉中齊墩果酸和熊果酸的含量,發(fā)現(xiàn)含量差異不大。說明莖和葉作為藥用部位沒有區(qū)別。另外,在實(shí)驗(yàn)過程中還比較混淆品種(湖北隨州、四川1和四川2)與正品。結(jié)果表明,混淆品種的甲醇提取物中并沒有齊墩果酸和熊果酸的色譜峰出現(xiàn)。這說明采用HPLC法測定齊墩果酸和熊果酸的含量,以此作為連錢草藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一是可行的。與前期紫外分光光度(UV)法測得的結(jié)果比較,H