抗藥抗體免疫原性分析辦法學(xué)驗證指導(dǎo)原則歐陽家百（.03.07）摘要：幾乎全部的生物制藥產(chǎn)品都會引發(fā)一定的抗藥抗體（anti-drugantibody，ADA）反映，抗藥抗體反映可能會減少藥品療效或造成嚴(yán)重的不良反映。在人體內(nèi)，抗藥抗體普通不會引發(fā)明顯的臨床反映。但是對于某些治療性蛋白質(zhì)，抗藥抗體反映能引發(fā)多個臨床的不良反映，涉及溫和事件及嚴(yán)重不良事件。臨床前研究表明，抗藥抗體能對藥品暴露、藥品毒性作用、藥品代謝動力學(xué)、藥品效應(yīng)動力學(xué)等造成影響。因此治療性蛋白質(zhì)的免疫原性引發(fā)了臨床醫(yī)生、藥企及監(jiān)管機構(gòu)的注意。為了評定生物藥品分子的免疫原性，以及將實驗成果與臨床事件聯(lián)系起來，在臨床前研究和臨床研究中，很有必要開發(fā)可靠的能夠有效評定抗藥抗體反映的實驗辦法。這里辦法學(xué)驗證顯得尤為重要，并且辦法學(xué)驗證是藥品上市申請必不可少的?，F(xiàn)行的監(jiān)管文獻(xiàn)對于免疫分析辦法的驗證的指導(dǎo)相稱有限，特別是缺少有關(guān)免疫原性分析辦法的驗證的指導(dǎo)。因此，本文對抗藥抗體免疫分析辦法的驗證提供科學(xué)的建議。在現(xiàn)有的有關(guān)生物分析的規(guī)范性文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上加入獨特的性能驗證。筆者建議采用實驗和統(tǒng)計學(xué)的辦法進(jìn)行免疫分析的辦法學(xué)驗證。這些建議被視為最佳的例子，旨在增進(jìn)整個醫(yī)藥行業(yè)形成一種更加統(tǒng)一的抗體檢測辦法。1．介紹：生物制藥產(chǎn)品涉及氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，普通通過人細(xì)胞系、哺乳動物細(xì)胞或細(xì)菌進(jìn)行體現(xiàn)，比常規(guī)的小分子藥品更大（普通不不大于1~3KD）。由于以上特性，生物制藥產(chǎn)品引發(fā)免疫反映的潛力更大。生物制藥的免疫原性與產(chǎn)品的內(nèi)在因素（種屬特異性表位、外源性、糖基化程度、聚合或變性程度、雜質(zhì)和制劑）、外在因素（給藥途徑、慢性或急性給藥、藥代動力學(xué)及內(nèi)源性當(dāng)量）、患者因素（本身免疫性疾病、免疫克制、和替代療法）有關(guān)。抗藥抗體反映可能會造成嚴(yán)重的臨床癥狀，涉及過敏、本身免疫和不同的藥代動力學(xué)特性（例如，藥品中和、生物分布異常和藥品去除率增強等均可能會使藥品的的療效發(fā)生變化）。藥品引發(fā)的免疫反映是藥品安全性和有效性的重要指標(biāo)，這也是監(jiān)管機構(gòu)、生產(chǎn)公司、臨床醫(yī)生和患者共同關(guān)注的。因此，美國食品藥品監(jiān)督管理局以及歐盟、日本、加拿大、澳大利亞等國家的監(jiān)管機構(gòu)均規(guī)定通過藥理學(xué)或毒理學(xué)有關(guān)的辦法對抗藥抗體進(jìn)行評定。免疫原性與臨床癥狀之間的有關(guān)性的研究依賴于臨床前研究和臨床研究中對于抗藥抗體的客觀檢測和表征。因此免疫原性生物分析辦法在用于檢測研究樣本之前應(yīng)進(jìn)行適宜的開發(fā)及驗證。已有出版物提供了有關(guān)抗藥抗體檢測和表征的方略、辦法開發(fā)及優(yōu)化等方面的指南。辦法學(xué)驗證是對分析辦法的評價，通過特定的實驗室辦法表明采用的分析辦法合用于對應(yīng)的檢測規(guī)定。具體到抗藥抗體的檢測辦法，驗證就是指證明該辦法能可靠的（例如一致性和重復(fù)性）在復(fù)雜的生物基質(zhì)（血清或血漿）中檢測出低量的藥品特異性抗體。辦法學(xué)驗證應(yīng)當(dāng)通過預(yù)先研究階段和研究階段兩個階段進(jìn)行，預(yù)先研究階段是指在分析樣品之前的工作，研究階段是指樣品的分析工作，預(yù)先研究階段和研究階段對于表明分析辦法的有效性和可控性同等重要。本文重要介紹抗藥抗體免疫分析辦法驗證的重要性能特性，推薦辦法學(xué)驗證有關(guān)的辦法和方法。本指南應(yīng)當(dāng)被視為最佳實踐范例，考慮到具體實際分析辦法時，在保持科學(xué)合理性和客觀性的狀況下，也能夠采用替代辦法。若采用替代辦法，建議與監(jiān)管機構(gòu)進(jìn)行充足討論。以細(xì)胞功效為基礎(chǔ)的中和抗藥抗體生物檢測和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫分析不在本指南的討論范疇內(nèi)。2.辦法2.1抗藥抗體檢測臨床和非臨床研究普通是通過對治療引發(fā)的抗藥抗體反映的檢測和表征來評定藥品的免疫原性?，F(xiàn)在可通過多個辦法可用于抗藥抗體的檢測，涉及酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫檢定法（RIA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等離子體共振（SPR）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）。每一種檢測辦法都有其優(yōu)點和局限性，在近來的文章中已進(jìn)行過討論[8,14]。不管是采用何種辦法，在辦法開發(fā)和優(yōu)化后均應(yīng)進(jìn)行正式的辦法學(xué)驗證，以確保該辦法適合對應(yīng)的檢測規(guī)定。因此能夠預(yù)測，本指南的驗證建議合用于大部分的抗藥抗體免疫檢測。研究人員應(yīng)根據(jù)檢測系統(tǒng)的特點擬定適宜的辦法學(xué)驗證方案。臨床研究中抗藥抗體的檢測和表征普通涉及四種不同類型的辦法。抗藥抗體檢測實驗普通涉及篩選實驗和特異性確證明驗，表征實驗普通涉及抗體滴定和中和抗體檢測[10]。應(yīng)用到具體研究樣本時，抗藥抗體分析實驗需要兩個核心決策參數(shù)，分別為篩選實驗的篩選臨界點（screeningcutpoint）和特異性確證明驗的特異性臨界點（specificitycutpoint）。篩選臨界點有助于抗藥抗體檢測成果的分類，高于篩選臨界點為活性樣品（活性樣品普通為潛在陽性樣品），低于臨界點為無活性樣品。活性樣品通過特異性確證明驗（如競爭性藥品克制信號通路）檢測是陽性（特異性活性）還是陰性（非特異性活性）。特異性臨界點為克制信號通路所需的樣品量，也就是具體藥品的抗藥抗體，需要通過實驗擬定。抗藥抗體的檢測辦法普通是非定量實驗（有時是半定量實驗），由于沒有可用的原則化的物種特異性的抗藥抗體作為校正原則品[15]。陽性對照普通都是內(nèi)部開發(fā)的（例如單克隆抗體或高免血清的多克隆抗體），不可能將受試者檢測到的全部抗藥抗體作為陽性對照。如果準(zhǔn)備使用質(zhì)量單位標(biāo)示抗藥抗體水平，那應(yīng)當(dāng)證明原則品和實驗樣品的平行性，以擬定樣品的濃度的精確性[8,10]。若未證明樣品與原則品間的平行性，則精確性是可疑的。滴定法是另一種評定抗體水平的辦法，該辦法不同樣品稀釋間容易缺少平行性。然而，值得注意的是已有研究表明，滴定法合用于抗體水平的評定。幾十年來，臨床上感染、本身免疫疾病的診療和治療以及防止接種等都采用這一辦法[16~22]。滴定法比較抗藥抗體反映更為簡便且所需的驗證工作更少，由于其不需要再對不同產(chǎn)品的抗藥抗體與原則品間的平行性進(jìn)行具體描述與證明。另外質(zhì)量單位法每當(dāng)原則品品變化時均需要進(jìn)行重新驗證?？偠灾?，兩種辦法都無法提供精確的定量數(shù)據(jù)。因此，贊助商建議采用相對濃度（質(zhì)量單位）或滴度表達(dá)抗藥抗體水平。某些監(jiān)管機構(gòu)會更傾向于使用滴度單位。滴度是仍能產(chǎn)生陽性成果的最大稀釋倍數(shù)的倒數(shù)。在辦法的開發(fā)和優(yōu)化階段，應(yīng)先擬定辦法并進(jìn)行統(tǒng)計，例如選擇所需的試劑、最佳濃度、預(yù)期樣品所需的最大稀釋倍數(shù)等。這些需要研究人員在預(yù)先研究階段進(jìn)行簡樸或重復(fù)確證。本文假定下列屬性在驗證之前已被確證：免疫分析方案及辦法設(shè)計，分析基質(zhì)的類型，最大稀釋倍數(shù)（MRD）、試劑的最佳濃度、酶標(biāo)板的均勻性評定（如位置的影響、漂移等）。監(jiān)管機構(gòu)可能會規(guī)定提供有關(guān)的數(shù)據(jù)支持。在辦法的開發(fā)和優(yōu)化階段，通過對對照品的檢測，對辦法的變異性有一種初步的認(rèn)識。2.2統(tǒng)計學(xué)的應(yīng)用減少驗證過程中的主觀作用是本文的重點之一。為了確保實驗的客觀性必須依靠于統(tǒng)計手段。由于大多數(shù)研究者無法獲得統(tǒng)計學(xué)家的服務(wù)，本文提供了簡樸且足夠嚴(yán)格和有效的統(tǒng)計學(xué)辦法。所涉及的統(tǒng)計計算都能夠采用商業(yè)統(tǒng)計軟件進(jìn)行計算，計算過程不需要經(jīng)驗豐富的統(tǒng)計學(xué)家。然而，如果有統(tǒng)計學(xué)家協(xié)助進(jìn)行驗證明驗設(shè)計和數(shù)據(jù)解決的話，統(tǒng)計學(xué)的應(yīng)用可能會比本文提供的更為嚴(yán)格和有效。3.預(yù)研究驗證臨床和非臨床研究中在開始樣品生物分析前的驗證明驗稱為預(yù)研究驗證，它重要從數(shù)學(xué)和可定量方面描述分析辦法的性能特性[8]。預(yù)驗證(prevalidation)是指研究工作啟動前的籌辦工作，兩者不能混淆。另首先，在研究驗證是指監(jiān)控整個辦法使用過程的性能特性，以確保辦法的有效性和數(shù)據(jù)的可靠性。通過完整的辦法開發(fā)和優(yōu)化后，分析辦法應(yīng)含有驗證的條件，如優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)表明檢測辦法含有潛在的可靠性和合用于對應(yīng)的檢測規(guī)定。辦法的可靠性依賴于分析設(shè)備和計算機系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)以及實驗人員的純熟程度。本質(zhì)上，分析辦法是包含多個因素的整體系統(tǒng)而不僅僅是試劑而已。驗證辦法應(yīng)涉及系統(tǒng)合用性，這屬于在研究驗證范疇。建議開始預(yù)研究驗證之前制訂對應(yīng)的驗證明驗方案或驗證明驗原則操作程序（SOP），驗證明驗方案應(yīng)闡明該辦法的預(yù)期目的、分析辦法的具體闡明、待驗證的性能特性以及精密度、穩(wěn)健性、穩(wěn)定性和耐用性的預(yù)期驗收原則。另外建議在驗證明驗方案中加入適宜的實驗細(xì)節(jié)和數(shù)據(jù)解決環(huán)節(jié)，這樣可覺得驗證人員提供一種明確的指導(dǎo)以確保更加好的解決數(shù)據(jù)?？顾幙贵w檢測應(yīng)建立對應(yīng)的驗收原則，有助于確保在研階段的實驗的有效性。為此，應(yīng)通過對驗證過程中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計評價后建立用于質(zhì)控的系統(tǒng)合用性原則（可接受范疇）。另外，在研驗證階段中間精密度實驗，對照品和樣品檢測也應(yīng)有對應(yīng)的驗收原則。當(dāng)在研驗證階段的分析數(shù)據(jù)不符合驗收原則時，應(yīng)回絕該數(shù)據(jù)。在預(yù)研驗證階段不應(yīng)建立驗收原則，由于這可能會使某些驗證數(shù)據(jù)被排除，造成不能精確預(yù)計分析誤差。除了可明因素（如技術(shù)誤差）、故意或無意偏離實驗方案所得分析數(shù)據(jù)應(yīng)被剔除外，預(yù)研階段的全部分析數(shù)據(jù)都應(yīng)計算在內(nèi)。現(xiàn)在，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）、國際協(xié)調(diào)會議（ICH）和美國藥典的指導(dǎo)性文獻(xiàn)敘述了定量檢測的分析驗證應(yīng)研究的普通性能特點[23~25]。由于抗藥抗體免疫分析屬于半定量檢測，因此有些規(guī)定并不不合用。對于抗藥抗體免疫分析辦法學(xué)驗證，應(yīng)對下列9項參數(shù)進(jìn)行測定：1.篩選臨界點2.確證臨界點3.敏捷度*4.系統(tǒng)合用性控制（QCs）驗收原則5.耐藥性*6.精密度7.魯棒性8.穩(wěn)定性*9.耐用性（有條件時）如果分析辦法的開發(fā)和優(yōu)化過程已充足闡明并得到適宜統(tǒng)計，在預(yù)研驗證階段不需要對以上標(biāo)有*的參數(shù)進(jìn)行重復(fù)驗證，盡管驗證報告中應(yīng)提供有關(guān)的數(shù)據(jù)。如果最后的辦法有所變動的話，預(yù)研驗證階段應(yīng)重新測定。抗藥抗體檢測辦法開發(fā)階段的預(yù)期用途和產(chǎn)品上市后的用途可能會不同。例如，在開發(fā)早期只有一種分析人員進(jìn)行實驗，開發(fā)工作完畢后和上市后可能會有多個分析人員進(jìn)行實驗。整個產(chǎn)品生命周期的驗證規(guī)定應(yīng)隨著檢測辦法應(yīng)用的變化而變化。然后，在藥品申請期間還是應(yīng)對以上列出的參數(shù)進(jìn)行驗證。傳統(tǒng)分析辦法的稀釋線性測試不合用于抗藥抗體檢測。當(dāng)使用滴度標(biāo)示抗藥抗體反映時，需要使用陽性對照，或者最佳使用累積抗藥抗體陽性樣品，在合理稀釋范疇內(nèi)不出現(xiàn)異常非線性。普通，在辦法開發(fā)階段都會涉及最大稀釋濃度（MRD）的選擇，驗證階段不需要進(jìn)行重復(fù)測定。如果出現(xiàn)前帶效應(yīng)，建議選擇一種不受前帶效應(yīng)影響的MRD，或者采用多個稀釋樣品。稀釋線性信息有助于設(shè)計系統(tǒng)適應(yīng)性質(zhì)量控制。3.1篩選臨界點篩選臨界點定義為篩選實驗的響應(yīng)水平，響應(yīng)值高于該臨界點的樣品為活性樣品（或者稱為潛在陽性），響應(yīng)值低于該臨界點的樣品為陰性樣品。一種有效的篩選臨界點需要在預(yù)研究驗證階段對某些列樣品測定值進(jìn)行系統(tǒng)性的統(tǒng)計分析擬定，所使用的樣品規(guī)定來自代表藥品使用目的群體或受試者。當(dāng)免疫分析的辦法存在錯誤風(fēng)險時，篩選實驗寧可出現(xiàn)假陽性也要避免假陰性[8,10]。如果篩選實驗中不能識別出活性樣品，應(yīng)懷疑該辦法檢測低陽性樣品的能力。約5%的篩選實驗的陽性成果為假陽性，從而確保能夠檢測出低陽性樣品[8]。在實踐中，假陽性成果總比沒有陽性成果好（如假陽性率可能不等于5%）。3.1.1篩選臨界點的類型能夠應(yīng)用于在研驗證階段的篩選臨界點共有三種：固定臨界點、浮動臨界點、動態(tài)臨界點。（a）固定臨界點：預(yù)研驗證階段擬定固定臨界點，然后應(yīng)用于在研驗證階段。固定臨界點用于測試樣品的分析，直到需要重新驗證或變化（如測定辦法發(fā)生核心變化、轉(zhuǎn)移到另一種實驗室進(jìn)行實驗或儀器升級等）。固定臨界值在一種目的人群的同一研究中或多目的人群的各研究間是固定的。當(dāng)預(yù)研究階段的整個實驗的均值相等、方差齊性時，采用固定臨界點。（b）浮動臨界點浮動臨界點有兩種計算辦法，分析過程中數(shù)據(jù)需要進(jìn)行對數(shù)（Log）轉(zhuǎn)換時，通過預(yù)研階段擬定的特定歸一化因子乘以在研階段的生物背景計算而得；分析過程無對數(shù)轉(zhuǎn)換時，計算辦法歸一化因子加上生物背景，生物背景能夠由陰性對照（由樣品的基質(zhì)構(gòu)成，抗藥抗體反映為陰性）、分析稀釋劑或預(yù)解決受試者樣品（個體特異性臨界點）標(biāo)示。浮動臨界點能夠是每一次實驗每一塊板（每一次實驗中的若干塊板）所特有的或每一種受試者所特有的（使用受試者的預(yù)解決/基線樣本成果）。如果采用個體特異性臨界點，需要在同一塊板上檢測預(yù)解決樣品和解決后樣品（或最少在同一實驗中檢測）。由于浮動臨界點的擬定過程需要對預(yù)研究驗證的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差預(yù)計，因此不同實驗間的成果應(yīng)體現(xiàn)出方差齊性。采用陰性對照進(jìn)行歸一化時，應(yīng)確保陰性對照成果能代表目的人群的藥品初治基質(zhì)樣品的成果，例如通過驗證陰性對照均值和生物基質(zhì)樣品均值在整個實驗中是有關(guān)聯(lián)的。如果均值有關(guān)，陰性對照均值合用于計算浮動臨界點。如果均值不有關(guān)，則使用稀釋液或預(yù)解決樣品成果進(jìn)行歸一化解決更為合理。（c）動態(tài)臨界點、同一實驗的不同板之間、同一研究的不同實驗間或不同研究間的動態(tài)臨界點均不同。動態(tài)臨界點的擬定不需要預(yù)研究階段的方差預(yù)計。這一特性將動態(tài)臨界點和浮動臨界點區(qū)別開來。只有當(dāng)不同實驗間的成果方差有明顯性差別時，才使用動態(tài)臨界點。實際使用時，動態(tài)臨界點的限制性因素是每次實驗都需要大量的樣本數(shù)才干擬定臨界點。建議優(yōu)先采用固定臨界點或浮動臨界點。如果實驗間的均值或方差存在差別，建議在采用動態(tài)臨界點之前先進(jìn)行差別來源調(diào)查。例如，若果差別來源于分析員或設(shè)備，則采用分析員或設(shè)備的固定臨界點或浮動臨界點替代動態(tài)臨界點。由于動態(tài)臨界點是一種不常見的非常規(guī)辦法，建議謹(jǐn)慎制訂該臨界點，最佳能與監(jiān)管機構(gòu)進(jìn)行充足溝通。3.1.2評定臨界點的樣品建議從適宜的人群中抽樣用于分析臨界點的評定。有時候需要在開始預(yù)研究驗證明驗之前從目的疾病人群中獲得樣品基質(zhì)是不實際的，甚至是不可能的。因此，普通從藥品初治健康受試者的樣本中進(jìn)行評定，并確立一種起始臨界點。該辦法合用于于臨床I期的研究。當(dāng)臨床研究開展到臨床II期后來，便可得到目的疾病患者的樣本，應(yīng)當(dāng)對不同的目的人群重新評定臨界點。如果目的人群和正常志愿者的響應(yīng)值的平均值和方差相稱，能夠使用同一種臨界點。如果沒有可比性，則需要采用目的疾病特異性的臨界點。為了擬定臨界點，在驗證階段應(yīng)分析足夠數(shù)量的樣本，這樣才干對生物和分析變異進(jìn)行有效的統(tǒng)計學(xué)評定。普通在臨床研究中，需要分析超出50個獨立受試者的樣本。非臨床研究最少需要15個樣品。不應(yīng)使用混合基質(zhì)樣品進(jìn)行臨界點評定，由于從混合樣品中測試重復(fù)的樣品，檢測的只是分析變異而不是生物變異。建議采用平衡實驗設(shè)計有效評定潛在的變異性來源（seeAppendixA）。如果將有多個分析員在研究過程進(jìn)行分析樣品操作，那么在預(yù)研究驗證階段應(yīng)最少涉及兩位分析員。如果研究過程中只有一種分析員進(jìn)行樣品分析，而這個分析員與驗證階段的分析員不同，預(yù)研究驗證階段也應(yīng)最少涉及兩位分析員。與否需要對同同樣品進(jìn)行重復(fù)實驗取決于在研驗證的報告形式（例如在微量滴定板中進(jìn)行兩個復(fù)孔或三個復(fù)孔）。3.1.3排除異常值應(yīng)確認(rèn)藥品初治患者的偶然活性樣本，以確保藥品的特異性。在這一點上，確證臨界點將不能真正確實認(rèn)陽性，此時應(yīng)當(dāng)使用科學(xué)的判斷辦法，應(yīng)排除無法擬定與否為偶然活性樣本。在分析臨界點的統(tǒng)計學(xué)評定時應(yīng)去除抗藥抗體陽性樣品和統(tǒng)計學(xué)異常樣品（樣品響應(yīng)值過高或過低）。由于下部極端異常值普通會使差別性波動從而影響臨界點，因此應(yīng)當(dāng)排除。去除較高或較低異常值會得到一種較低的臨界點，普通會增加假陽性率而變得更為謹(jǐn)慎（假陽性樣本會在隨即的特異性確證明驗中被證明為陰性）。如果在臨界點評定中使用了強大的統(tǒng)計辦法（例如基于中位數(shù)的辦法，圖基的Tukey’sbiweight函數(shù)），則不需要排除異常點。3.1.4擬定篩選臨界點為了擬定篩選臨界點的類型，需要進(jìn)行一系列的數(shù)據(jù)評定，如圖1所示。首先，如果使用參數(shù)預(yù)計的辦法，需要對藥品初治的樣本成果的分布類型進(jìn)行檢查（正態(tài)分布檢查），如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則能夠?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行適宜的轉(zhuǎn)換（如對數(shù)轉(zhuǎn)換），然后排除異常值（AppendixB.1）。如果不需要用到參數(shù)預(yù)計（第95百分位），則不需要進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，但仍需要排除異常值。另首先，采用單因素方差分析（ANOVA-basedstatisticalmethods）的統(tǒng)計學(xué)辦法解決比較每一次實驗運行的平均值和方差，從而決定采用固定臨界點、浮動臨界點還是動態(tài)臨界點（AppendixB.2）。在浮動臨界點的評價過程中，如果歸一化過程使用了陰性對照，則應(yīng)當(dāng)將陰性對照的均值與目的人群的基質(zhì)樣本進(jìn)行比較，以擬定與否適合使用陰性對照。最后，基于以上評定，使用適宜的統(tǒng)計學(xué)辦法計算出臨界點（AppendixB.3）。3.2確證臨界點特異性是分析辦法在其它基質(zhì)成分存在的條件下明確檢測目的分析物的能力[23]。篩選實驗篩選出活性樣品（普通稱為潛在陽性），由于篩選臨界點允許5%的假陽性率，因此這些活性樣品可能是非特異性的。因此從活性樣品中鑒定出陽性樣品需要藥品的特異性活性。檢測人源樣本的抗藥抗體特異性是一種常見的做法，動物樣本也同樣。特異性確證明驗普通是一種競爭性克制實驗，通過檢測含或不含預(yù)孵育研究藥品的樣品的信號變化來進(jìn)行評定。另外還可通過比較相似大小和電荷的免疫無關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行評定。尚有某些研究者通過比較加藥和不加藥的信號區(qū)別進(jìn)行評定，然而本文建議與監(jiān)管機構(gòu)主動討論這一辦法的可接受性。以上的任何一種辦法，確證陽性信號的變化值稱為確證臨界點。確證臨界點將抗體與藥品的特異性結(jié)合和非特異性結(jié)合區(qū)別開來，其有效性非常核心，必須客觀評定。不激勵使用50%信號克制等主觀原則。信號略高于臨界點的低信號的抗藥抗體弱陽性樣品的評價尤為重要?？顾幙贵w強陽性藥品需要用過量的藥品進(jìn)行競爭性克制，因此普通不會出現(xiàn)這一問題。當(dāng)評價抗藥抗體弱陽性樣品時，即使是加標(biāo)藥品樣品的信號很細(xì)微的削弱都可能會使相對應(yīng)的未加標(biāo)藥品樣品的信號減少50%以上，從而造成假陽性。另外，只有將抗藥抗體陽性樣品的信號下降到背景信號，這信號強度只有未克制樣品信號的50%下列，這樣可能會出現(xiàn)假陰性。因此，特異性確證臨界點應(yīng)當(dāng)通過客觀的辦法進(jìn)行評定，在弱陽性樣本附近評定分析辦法的變異性。有多個實驗辦法能夠用于特異性確證臨界點的評定。建議在篩選臨界點的驗證過程評定特異性確證臨界點。篩選臨界點評定實驗所用到的藥品初治樣本能夠加入藥品后再以相似的方式檢查。計算未加標(biāo)藥品樣本（克制）的均值和原則偏差（SD），特異性確證臨界點為克制平均值加上3.09倍的SD值（如果預(yù)期假陽性率為1%）。與篩選臨界點的評定同樣，特異性確證臨界點的評定過程也需要排除異常值。特異性確證臨界點的具體計算環(huán)節(jié)參見附錄C（AppendixC）。在某些實驗室，會在低于篩選臨界點的樣品（建議樣本量不不大于等于25）中加標(biāo)陽性對照使其信號值等于或稍微不不大于篩選臨界點。用過量藥品孵育后，計算平均克制百分率，并通過“×SD”值進(jìn)行校正，擬定特異性確證臨界點（“×”取決于適宜的假陽性率）。必須確保陽性對照樣品的信號不會高于篩選臨界點太多，以免使假陽性率增高。這一辦法擬定的特異性確證臨界點高度依賴于所使用的陽性對照品。值得注意的是，研究樣本中的低抗藥抗體親和力樣本（特別是多價IgM，親和力成熟的IgG）可能會不被克制。因此，使用單一陽性對照品擬定的特異性確證臨界點可能無法有效地將一種研究樣品分為特異性樣品還是非特異性樣品。Neyer等提出了一種基于T檢查（t-test）的表達(dá)抗藥抗體特異性的辦法，該辦法的原理是比較未加標(biāo)藥品樣品與加標(biāo)藥品樣品的信號值。然而，該分析法的競爭性克制成果的觀察樣本量相稱有限，沒有考慮到生物變異的影響。然而，以上列舉的辦法均比人為的50%克制率更為客觀、可靠。某些研究人員進(jìn)行抗體免疫耗竭（如ProteinA），這一辦法并不涉及特異性藥品，它只能證明信號來源于免疫球蛋白。這種辦法能夠用作支撐測試，不建議作為藥品特異性的決定性實驗。3.3敏捷度完全定量辦法普通采用適宜的參考原則曲線來預(yù)計分析辦法敏捷度，而抗藥抗體分析的敏捷度高度依賴于所用的陽性對照試劑。例如，在同一種分析實驗中，使用高親和力陽性對照品得到的敏捷度優(yōu)于低親和力陽性對照品。因此當(dāng)有一種以上的陽性對照品時，普通會發(fā)現(xiàn)不同的陽性對照品會得到不同的敏捷度。另外，沒有一種陽性對照品能表達(dá)出不同化合物解決后的免疫應(yīng)答圖譜。盡管如此，分析敏捷度提供了分析辦法的普通有關(guān)性，需要進(jìn)行測定并報告。敏捷度有助于在分析辦法開發(fā)階段選擇最優(yōu)的抗藥抗體檢測辦法（辦法開發(fā)起始階段比較不同辦法），也有助于擬定低陽性對照品的驗證?？顾幙贵w分析的敏捷度指陽性對照抗體能穩(wěn)定產(chǎn)生陽性信號的最低濃度。例如，預(yù)期實驗的成果的95%高于篩選臨界點的對照抗體的濃度，具體的比例取決于一致性水平。擬定分析敏捷度的實驗辦法參見附錄D（Appendix）。3.4系統(tǒng)合用性控制系統(tǒng)合用性控制確保了分析辦法的有效性[24]。分析辦法普通都包含一系列的質(zhì)量控制（強、弱陽性對照和陰性對照），這些質(zhì)量控制確保了性能的一致性，從而確保了成果的有效性。換言之，系統(tǒng)適應(yīng)性控制有助于確保了分析辦法在整個研究階段都是有效的。因此，系統(tǒng)合用性控制協(xié)助確認(rèn)實驗運行與否通過驗證的驗收原則。有關(guān)系統(tǒng)合用性控制開發(fā)和有關(guān)的驗收原則的具體信息參見附錄E（AppendixE）。3.5選擇性/干擾性（耐藥性）考慮到樣品中的其它組分可能會影響抗藥抗體的檢測。選擇性就是指分析辦法在其它組分存在的狀況下檢測目的物質(zhì)的能力[27]，通過從含有潛在干擾組分（多個）的樣品中檢測分析物（模擬陽性對照品）的回收率來進(jìn)行表征。當(dāng)陽性對照和樣品基質(zhì)來源于不同物種時，anti-framework抗體和抗異種抗體經(jīng)常會妨礙陽性對照品的回收。注意當(dāng)使用陽性對照時，抗藥抗體分析的選擇性不太可能會影響測定臨床或非臨床樣品的選擇性。盡管如此，還是很有必要去理解抗藥抗體檢測的實驗條件，基質(zhì)中可能含有研究藥品、內(nèi)源性抗體、合并用藥和類風(fēng)濕因子等。3.5.1基質(zhì)成分的干擾抗藥抗體分析的回收率評定涉及在實驗條件下檢測基質(zhì)成分與否會克制抗藥抗體與藥品的結(jié)合。如果可能的話，選擇性研究應(yīng)涉及陽性對照與疾病狀態(tài)下的血清的對照實驗，由于某些人群或疾病狀態(tài)下可能會產(chǎn)生干擾性物質(zhì)。如果有明顯比例的測試樣本出現(xiàn)溶血或高血脂，則需要進(jìn)行回收率評價。為了擬定目的基質(zhì)樣品的回收率，應(yīng)將高、低濃度的特異性抗藥抗體對照品（單克隆或多克?。┘尤敕治鼍彌_液（不含基質(zhì)成分）、健康個體的生物基質(zhì)（血清或血漿）、治療人群樣本。比較緩沖液的響應(yīng)值與生物基質(zhì)的響應(yīng)值，可接受原則普通為兩者的差別超出20%，具體差別取決于所用的陽性對照。在實驗中選擇體現(xiàn)高、低非特異性背景的捐助者是很有協(xié)助的。不僅能夠檢測回收率，還能檢查基質(zhì)的干擾性，確證最小稀釋濃度（MRD）。3.5.2藥品干擾研究（耐藥性）抗藥抗體檢測的重要干擾物質(zhì)普通來自藥品本身。由于目的藥品和實驗過程用到的捕獲試劑的特異性抗體的產(chǎn)生存在競爭性作用，含藥樣品可能存在干擾物質(zhì)，造成出現(xiàn)假陰性。普通的做法是擬定克制陽性對照抗體檢測的藥品濃度，并將此耐藥程度應(yīng)用于研究樣本抗藥抗體狀態(tài)的決策方面。這一做法存在一定的缺點，由于耐藥性高度依賴于所使用的陽性對照，在同一種實驗中，使用高親和力陽性對照能夠獲得較低的耐藥性，而低親和力對照獲得的耐藥性更高。由于抗藥抗體存在個體差別性，因此研究樣本的抗體獲得的真正的耐藥性可能會與陽性對照的耐藥性不同。事實上，當(dāng)有一種以上陽性對照時，普通會發(fā)現(xiàn)每一種陽性對照會對應(yīng)一種不同的耐藥性值。因此，真正的耐藥性是無法擬定的。與敏捷度類似，耐藥性僅限于理解實驗中藥品與否會產(chǎn)生干擾，在辦法的開發(fā)和優(yōu)化階段能夠用于比較不同辦法。盡管如此，擬定耐藥性是監(jiān)管盼望。為了測定藥品的耐藥性，先用系列稀釋的藥品對低濃度ADAQC進(jìn)行預(yù)孵育，然后再進(jìn)行檢測?？酥频蜐舛萉C信號檢測的最低藥品濃度就是實驗的藥品耐受限，該耐受限會隨著陽性對照的不同而變化。研究階段的生物分析報告中，當(dāng)在抗藥抗體陰性的樣本中檢測藥品時，建議附上該抗藥抗體陰性樣本可能隨著的藥品干擾聲明。3.6精密度精密度是指分析辦法一系列隨機測量值的變異程度，精密度的可接受原則應(yīng)當(dāng)在免疫分析的慣用預(yù)期范疇內(nèi)；同時也應(yīng)當(dāng)適合所用的平臺（例如，電化學(xué)發(fā)光法的原則要嚴(yán)于Elisa法）。建議采用平衡實驗設(shè)計進(jìn)行精密度性能驗證，如附錄A（AppendixA）所示。篩選實驗、特異性確證明驗和滴定辦法的精密度擬定辦法以下。如果可行，建議在研究階段將精密度實驗適宜放大至預(yù)期實際使用規(guī)模。3.6.1篩選實驗精密度對實驗對照品（陰性對照、高、低濃度陽性對照）進(jìn)行最少6次獨立檢測，分析對應(yīng)數(shù)據(jù)擬定篩選實驗精密度。以上數(shù)據(jù)能夠通過附錄D（AppendixD）所述的敏捷度擬定實驗獲得。從以上實驗中計算出高濃度陽性樣品和低濃度陽性樣品（剛好高于臨界點）的不精確性，不精確性能夠用變異系數(shù)（CV%）表達(dá)，變異系數(shù)表征了先關(guān)變異的來源。批內(nèi)分析精密度（也稱批內(nèi)精密度或內(nèi)部運行精密度）和中間精密度（也稱運行間精密度、批間精密度、中間精密度或整體精密度）都應(yīng)當(dāng)用變異系數(shù)CV%表達(dá)，例如近來出版物的表達(dá)方式[27]。如果分析研究樣本是使用了分析員特異性臨界點，則應(yīng)當(dāng)測定分析員中間精密度（inter-analystCV）。3.6.2特異性確證明驗精密度特異性確證明驗精密度的目的是檢測信號克制的重復(fù)性。為了計算百分克制率（%），特異性確證臨界點的擬定實驗中，在最少6次獨立運行中，往高、低濃度對照組中加入適量的藥品。以上實驗已有足夠的數(shù)據(jù)計算批間精密度，計算方式如3.6.1.3.7穩(wěn)健性魯棒性能夠批示分析辦法的可靠性。魯棒性是指當(dāng)辦法的參數(shù)發(fā)生故意的微小變化時，分析辦法不受影響的能力[23]。魯棒性關(guān)注的是在原則實驗室發(fā)生真實生活的變化時分析辦法的一致性。驗證過程中魯棒性參數(shù)測定需要基于具體的分析方及其有關(guān)風(fēng)險[28]。應(yīng)當(dāng)評定特定實驗室哪些實驗條件可能發(fā)生變化，并設(shè)計適宜的測試，以檢查被認(rèn)為核心的參數(shù)。涉及微孔板批次、孵育時間、溫度、每一次運行的微孔板數(shù)、試劑批次和濃度或者設(shè)備。研究樣本或陽性對照樣本都可用于檢測魯棒性。建議在魯棒性驗證過程中使用系統(tǒng)合用性控制的驗收原則（在辦法開發(fā)和優(yōu)化階段計算或驗證系統(tǒng)合用性驗收原則）3.8穩(wěn)定性穩(wěn)定性研究評定分析辦法在預(yù)期樣品的儲存條件下的分析性能。抱負(fù)狀態(tài)下，穩(wěn)定性測試條件應(yīng)模仿預(yù)期樣品和試劑的裝卸條件、儲存溫度和不同的儲存時間?？紤]到分析物的穩(wěn)定性，抗藥抗體的本質(zhì)屬性值得深思。不管抗藥抗體分析物是抗X藥品抗體還是抗Y藥品抗體，他們都是多克隆抗體。因此，有理由認(rèn)為抗藥抗體的穩(wěn)定性都是同樣的。按照這一邏輯，抗藥抗體的穩(wěn)定性靠近血清或血漿中任意抗原的免疫球蛋白的穩(wěn)定性。建議對每一物種的的基質(zhì)樣本分開進(jìn)行穩(wěn)定性表征，無論是臨床的還是非臨床的，然后在研究實驗室內(nèi)將實驗成果推廣至全部的藥品檢測項目，有必要檢測來自目的適應(yīng)癥（如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）的基質(zhì)。因此，并未規(guī)定分析不同藥品時樣品穩(wěn)定性都要分開進(jìn)行驗證。需要注意一種事實，當(dāng)不同受試者注射不同的藥品時，產(chǎn)生的IgM，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4的比例各不相似，不能夠懂得并模擬不同人群的免疫球蛋白的比例。因此使用該法評價分析物質(zhì)的穩(wěn)定性是合理的。加了陽性對照的藥品初治基質(zhì)能夠用作模擬陽性樣本進(jìn)行穩(wěn)定性測定，但是這樣的樣本與否能合理的模擬預(yù)期測試樣品需要科學(xué)的判斷。最佳是能有多個不同濃度的陽性樣品，最少也要包含一種強陽性對照和一種弱陽性對照。更具體的信息參見附錄F（AppendixF）。穩(wěn)定性表征還應(yīng)涉及核心試劑的穩(wěn)定性，如質(zhì)量